生成Runx突变小鼠模型
评估Runx蛋白末端Y残基突变对T细胞发育的影响
通过CRISPR/Cas9产生Runx3WRPW和Runx1WRPW等突变小鼠，分析胸腺和脾脏T细胞亚群。
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Runx蛋白磷酸化控制辅助性CD4+ T细胞与细胞毒性CD8+ T细胞谱系选择
Phosphorylation of Runx protein controls helper CD4+ T cell versus cytotoxic CD8+ T cell lineage choice
实验完整度
高包含转基因小鼠模型（Runx3WRPW、Runx1WRPW）、细胞系（Jurkat）、患者样本（胸腺细胞）及分子机制验证（质谱、ChIP-seq、PLA）。
主要模型
小鼠CD4 SP和CD8 SP胸腺细胞 Jurkat和J.CaM1.6细胞系 Runx3突变小鼠模型 OT-I和OT-II转基因TCR小鼠
重点核对
Runx3WRPW/W和Rx3+/W小鼠中CD8 SP胸腺细胞发育情况 R26DP-R1-WRPW小鼠中MHC-II限制性胸腺细胞重定向至CD8谱系 Jurkat细胞中末端Y磷酸化（LEEAVWRPpY）的检测 CD8 SP和CD4 SP胸腺细胞中Runx1-Lck相互作用差异 TLE3与Cd4沉默子的结合（ChIP-qPCR）
摘要
MHC-I- and MHC-II-selected CD4+CD8+ precursor thymocytes differentiate into cytotoxic CD8+ and helper CD4+ lineage T cells, during which suppression of Cd4 and Thpok genes by Runx-dependent-silencers in those genes is crucial to segregate the two lineages. However, how TCR signals are linked to cytotoxic-lineage-specific Cd4-Thpok silencing remains unclear. Here we show that the terminal Y residue within the evolutionarily conserved C-terminal WRPY motif in Runx1, which is essential for interacting with TLE co-repressor proteins, was phosphorylated more in CD4-CD8+ thymocytes than in CD4+CD8- thymocytes, inducing an interaction with TLE co-repressors for cytotoxic-lineage specific Cd4-Thpok silencing. Non-receptor tyrosine kinases Lck and Zap70 interacted with Runx in the cytoplasm more in MHC-I-signaled CD4-CD8+ thymocytes than in CD4+CD8- thymocytes. Collectively, these findings reveal that differential phosphorylation states at the terminal tyrosine residue in Runx connect MHC restriction with the helper versus cytotoxic T cell lineage choice.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TCR信号如何通过MHC限制性信号与细胞毒性谱系特异的Cd4-Thpok沉默相关联？
- 核心机制
- Runx1末端Y残基磷酸化状态调节其与TLE共抑制因子的相互作用，从而激活毒性谱系特异的Cd4和Zbtb7b沉默子。
- 主要证据
- Runx3WRPW突变，末端Y磷酸化水平在CD8 SP中更高，Runx1-Lck互作在CD8 SP中更多，TLE3结合Cd4沉默子在CD8 SP中增强。
- 研究意义
- 揭示了MHC-I信号与转录调控之间的连接机制，为理解谱系决定提供了新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外磷酸化检测
确定Runx1末端Y残基是否发生磷酸化
在Jurkat细胞中表达Ty1-Runx1，用pervanadate处理，通过免疫沉淀和质谱检测磷酸化肽段。
原代细胞中磷酸化水平比较
比较CD4 SP和CD8 SP胸腺细胞中Runx1末端Y磷酸化差异
从OT-II和OT-I小鼠分离CD4 SP和CD8 SP，免疫沉淀Ty1-Runx1，PRM定量磷酸化和非磷酸化肽段。
体内模型验证功能
验证Runx磷酸化在谱系选择中的作用
利用R26DP-R1-WRPW等转基因小鼠，观察MHC-II限制性细胞是否重定向至CD8谱系。
分子相互作用分析
阐明磷酸化调节Runx与TLE相互作用的机制
通过共免疫沉淀、PLA、AlphaScreen和分子动力学模拟分析Runx-TLE互作。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | Cas9 mRNA | -- | -- |
| 单链向导RNA | Integrated DNA Technology | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 病毒转导 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 组织处理 | ACK裂解缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C-5138 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | FUJIFILM | 043-26773 | |
| 流式细胞术 | 转录因子缓冲液套装 | BD Biosciences | -- |
| LIVE/DEAD固定死细胞染色试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FACSCanto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞周期分析 | SYTOX Green核酸染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| NEBNext RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞分选 | EasySep小鼠链霉亲和素RapidSpheres分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| RT-qPCR | SuperScript IV逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| QuantStudio 3实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 通用探针库 | Roche | -- | |
| ChIP-seq | 抗组蛋白H3K27me3抗体 | Cell Signaling Technology | C36B11 |
| 抗组蛋白H3K4me3抗体 | Cell Signaling Technology | C42D8 | |
| 抗RUNX3抗体 | Cell Signaling Technology | D6E2 | |
| Dynabeads M-280羊抗兔IgG磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Covaris S220超声破碎仪 | Covaris | -- | |
| ChIP-qPCR | 双琥珀酰亚胺戊二酸酯 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PicoRuptor 2超声破碎仪 | Diagnode | -- | |
| 抗TLE3抗体 | Proteintech | 11372-1-AP | |
| Dynabeads蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ChIP DNA清洁和浓缩试剂盒 | ZYMO Research | -- | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| AlphaScreen | AlphaScreen IgG（蛋白A）检测试剂盒 | Perkin Elmer | -- |
| 质谱 | 胰蛋白酶/Lys-C混合酶 | Promega | -- |
| GL-Tip SDB脱盐柱 | GL Sciences | -- | |
| EASY-nLC 1200超高效液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| C18反相色谱柱 | Nikkyo Technos | -- | |
| 免疫共沉淀 | Dynabeads蛋白A磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗Ty1抗体 | Invitrogen | MA5-23513 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| 抗Gapdh抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32233 | |
| ECL Prime Western blot检测试剂 | Cytiva | -- | |
| Amersham Imager 680成像仪 | Cytiva | -- | |
| 碱性磷酸酶 | Roche | 11097075001 | |
| PLA | 抗TY1标签抗体 | GenScript | A01004 |
| 抗FLAG标签抗体 | Sigma-Aldrich | E3165 | |
| 抗Lck抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-433 | |
| 抗Bcl11b抗体 | Bethyl Laboratories | A300-383A | |
| 抗Zap70抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-32760 | |
| Duolink原位PLA探针抗小鼠PLUS | Sigma-Aldrich | -- | |
| Duolink原位PLA探针抗兔MINUS | Sigma-Aldrich | -- | |
| Duolink原位检测试剂橙色 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Duolink原位封片剂含DAPI | Sigma-Aldrich | -- | |
| BZ-X810显微镜 | Keyence | -- | |
| ECLIPSE Ti-TIRF显微镜 | Nikon | -- | |
| 细胞培养 | GP2-293细胞 | Clontech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系：C57BL/6N、ICR；基因编辑方法：CRISPR/Cas9；突变类型：Runx3WRPW、Runx1WRPW等 阅读提示：Methods: Mice 部分 |
| 细胞培养 | Jurkat和J.CaM1.6细胞培养条件：RPMI-1640、10% FBS；转导方法：逆转录病毒 阅读提示：Methods: Cells 部分 |
| 磷酸化检测 | pervanadate浓度：500 μM，H2O2 3 mM；处理时间：37°C 15分钟；质谱参数 阅读提示：Methods: Mass spectrometry 部分 |
| 免疫沉淀 | 抗体：anti-Ty1 (MA5-23513)、anti-TLE3 (11372-1-AP)；细胞数量：CD4 SP 10^6，外周CD8 10^7；裂解缓冲液组成 阅读提示：Methods: Co-immunoprecipitation and immunoblotting 部分 |
| PLA | 抗体组合、稀释度、固定和透化条件；显微镜设置 阅读提示：Methods: In situ PLA 部分 |