体外CAR T细胞杀伤和细胞因子产生分析
评估CD28阻断或缺失对CAR T细胞短期细胞毒性和细胞因子产生的影响
将hBCMABBζ CAR T细胞与MM.1S或U266细胞共培养，加入abatacept，检测细胞毒性和细胞因子水平
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内源性CD28驱动骨髓瘤和淋巴瘤模型中CAR T细胞的持久活性
Endogenous CD28 drives the persistent activity of CAR T cells in myeloma and lymphoma models
实验完整度
高包含体外共培养杀伤、反复刺激实验、CD28敲除/诱导敲除小鼠模型、异种移植和同系小鼠模型，以及代谢分析、细胞因子检测和患者样本分析，并进行功能与机制验证。
主要模型
人BCMA靶向4-1BB CAR T细胞（hBCMABBζ） 小鼠BCMA靶向4-1BB CAR T细胞（hBCMAmBBmζ） 小鼠CD19靶向4-1BB CAR T细胞（mCD19mBBmζ） MM.1S和5TGM1骨髓瘤小鼠模型，A20淋巴瘤小鼠模型
重点核对
CD28阻断或敲除对CAR T细胞体内持久性的影响 CD28缺失对线粒体氧化磷酸化和氧化还原平衡的影响 CD28缺失对CAR T细胞体内扩增的影响 CD28阻断对肿瘤微环境细胞因子水平的影响 肿瘤细胞CD86表达与CAR T细胞治疗后CRS严重程度的相关性
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法已重塑多发性骨髓瘤（MM）的治疗格局，但大多数接受BCMA靶向CAR T细胞治疗的患者会出现疾病复发。因此，我们试图确定抑制CD28存活信号能否增加MM对CAR T细胞治疗的敏感性。与预期相反，阻断CD28与CD80/86的相互作用加速了临床前MM和淋巴瘤CAR T治疗模型中的肿瘤再生长。基因敲除研究表明，4-1BB共刺激CAR T细胞上的内源性CD28延长了体内活性，重编程线粒体代谢以维持氧化还原平衡，并刺激肿瘤微环境中肿瘤模型特异性炎症因子的增殖和释放。有趣的是，短暂的CD28阻断降低了某些TME细胞因子水平，但没有显著影响CAR T细胞治疗小鼠的存活。总的来说，这些数据提供了直接证据，表明内源性CD28信号调节多发性骨髓瘤和淋巴瘤模型中的CAR T细胞反应。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 阻断CD28信号能否使骨髓瘤对CAR T细胞治疗敏感，以及内源性CD28在4-1BB共刺激CAR T细胞功能中的作用。
- 核心机制
- 内源性CD28信号增强4-1BB共刺激CAR T细胞的线粒体氧化代谢，维持氧化还原平衡，促进体内扩增和肿瘤微环境中促炎细胞因子的产生。
- 主要证据
- 使用CD28敲除或诱导敲除的CAR T细胞、abatacept阻断及多种体内模型，观察到CD28缺失或阻断导致CAR T细胞持久性降低、代谢异常、扩增减少和细胞因子释放改变。
- 研究意义
- 证明内源性CD28对4-1BB共刺激CAR T细胞的持久抗肿瘤活性至关重要，并提示短暂阻断CD28可能减轻细胞因子释放综合征，为优化CAR T细胞治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
反复刺激实验评估持久性
评估内源性CD28对CAR T细胞持久杀伤活性的影响
将CD28野生型或CRISPR敲除的hBCMABBζ CAR T细胞与U266或U266tCD86细胞反复共培养，每两天传代，评估杀伤活性
体内异种移植和同系小鼠模型评估抗肿瘤效果
评估CD28阻断或敲除对CAR T细胞抗肿瘤活性的影响
NSG小鼠接种MM.1S-luc，Rag2-/-小鼠接种5TGM1hBCMA-luc，给予CAR T细胞±abatacept，监测肿瘤负荷和生存；BALB/c小鼠接种A20细胞，用环磷酰胺预处理，给予mCD19mBBmζ CAR T细胞±abatacept
CD28诱导敲除小鼠模型验证
确定CD28对CAR T细胞功能的固有作用
从CD28iKO或CD28fl/fl小鼠制备CAR T细胞，经4-OHT处理诱导CD28敲除，体内评估抗肿瘤活性和B细胞发育不全维持
代谢分析
评估CD28对CAR T细胞代谢的影响
用Seahorse分析CD28fl/fl和CD28iKO CAR T细胞的糖酵解和线粒体呼吸，检测NADH/NAD+比例和线粒体ROS
体内CAR T细胞扩增评估
评估CD28对CAR T细胞体内扩增的影响
使用T-lux CAR T细胞进行生物发光成像，监测ab atacept处理后的CAR T细胞扩增；通过流式细胞术检测骨髓和血液中CAR T细胞频率
肿瘤微环境细胞因子分析
评估CD28对CAR T细胞诱导的细胞因子产生的影响
收集骨髓或肝脏肿瘤组织，用CodePlex或Luminex检测细胞因子水平
患者样本分析
探索CD86表达与CAR T治疗毒性之间的关联
分析23例CAR T细胞治疗的MM患者骨髓中CD138+细胞CD86表达，并回顾卡氏细胞因子释放综合征和ICAN事件
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 动物实验 | 阿巴西普 | -- | -- |
| 细胞培养 | Dynabeads磁珠 | ThermoFisher | -- |
| Retronectin | Takara Bio | -- | |
| FuGENE 4K转染试剂 | Promega | E5911 | |
| Lonza支原体检测试剂盒 | Lonza | -- | |
| AmpFLSTR Identifiler Plus PCR扩增试剂盒 | ThermoFisher | A26182 | |
| Applied Biosystems Verti 96孔热循环仪 | ThermoFisher | -- | |
| Applied Biosystems 3130xl遗传分析仪 | ThermoFisher | -- | |
| 药物处理 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | -- |
| 环磷酰胺 | -- | -- | |
| 细胞因子检测 | CodePlex分泌组芯片 | Isoplexis | CODEPLEX-2L10 |
| Milliplex Th17预混面板 | Millipore | HT17MG-14K-PX25 | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Cell-Tak涂层XFe96微孔板 | Agilent Technologies | 103794-100 | |
| Seahorse XF DMEM培养基pH7.4 | Agilent Technologies | 103575-100 | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | -- | -- | |
| 依托莫昔 | -- | -- | |
| UK5099 | -- | -- | |
| BPTES | -- | -- | |
| BAM15 | -- | -- | |
| Hoechst 33342核染色 | ThermoFisher | H3570 | |
| BioTek Cytation 5细胞成像多功能读板机 | Agilent Technologies | -- | |
| NAD/NADH-Glo检测 | Promega | -- | |
| 流式细胞术 | LIVE/DEAD固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L34962 |
| LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Cytek Aurora全光谱分析仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| 分子生物学 | Alt-R S.p. Cas9核酸酶 | Integrated DNA Technologies | 1081059 |
| P3原代细胞4D-Nucleofector试剂盒 | Lonza | V4XP-3024 | |
| 聚-L-谷氨酸 | Millipore Sigma | P4886 | |
| 细胞培养 | Pan CD3+小鼠T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19851 |
| 重组小鼠IL-2 | BioLegend | 575406 | |
| 重组小鼠IL-7 | BioLegend | 577804 | |
| 重组人IL-2 | Peprotech | 200-02-50UG | |
| 重组人IL-7 | Peprotech | 200-07-10UG | |
| Ficoll-Paque PLUS分离液 | Cytiva | 45-001-749 | |
| T细胞TransAct聚合物纳米基质 | Miltenyi Biotec | 130-111-160 | |
| One-glo EX荧光素酶报告检测 | Promega | E8130 | |
| 细胞因子检测 | CodePlex分泌组小鼠炎症检测板 | Isoplexis | PANEL-2L10 |
| CodePlex分泌组人类适应性免疫检测板 | Isoplexis | PANEL-2L01 | |
| Luminex Discovery检测 | R&D | LXSAMSM-06 | |
| Luminex xMAP INTELLIFLEX系统 | Millipore Sigma | -- | |
| 统计学分析 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外CAR T细胞杀伤实验 | 效应细胞与靶细胞比例、共培养时间、靶细胞类型（MM.1S或U266）、是否添加abatacept及其浓度 阅读提示：Methods: In vitro cytotoxicity assays |
| 反复刺激实验 | 靶细胞类型（U266或U266tCD86）、CAR T细胞来源（健康供者）、E:T比例、刺激间隔和持续时间 阅读提示：Methods: Repeated antigen stimulation assays |
| 体内异种移植模型 | 小鼠品系（NSG）、肿瘤细胞系（MM.1S-luc）、接种剂量和时间、CAR T细胞剂量和输注时间、abatacept给药方案 阅读提示：Methods: Mice and in vivo CAR T models; Fig 2A |
| 体内同系淋巴瘤模型 | 小鼠品系（Balb/c）、肿瘤细胞系（A20）、接种剂量和时间、环磷酰胺预处理剂量和时间、CAR T细胞剂量和输注时间、abatacept给药方案 阅读提示：Methods: Syngeneic BCL Model; Fig 3A |
| CD28诱导敲除模型 | 小鼠品系（CD28iKO）、4-OHT浓度和处理时间、CAR T细胞制备和输注剂量 阅读提示：Methods: CD28iKO; Fig 2F |
| 代谢分析 | 刺激条件（5TGM1hBCMA共培养）、Seahorse试剂浓度、细胞接种密度、CD28敲除状态 阅读提示：Methods: Seahorse |
| 细胞因子分析 | 样本采集时间点（治疗后7天）、组织处理方式、使用的检测平台（CodePlex或Luminex） 阅读提示：Methods: Cytokine analyses |
| 患者样本分析 | 患者数量、CD86阳性阈值、CRS分级标准、免疫相关不良事件的定义 阅读提示：Methods: Myeloma patient data; Supplemental Table 1 |