评估RMC-9945对肝转移模型的治疗效果
确定RMC-9945在不同阶段肝转移中的抗肿瘤活性。
使用AKTP MTOs经脾注射建立肝转移模型，在不同时间点（d15、d21、d25）开始RMC-9945治疗（100 mg/kg，每日一次），评估转移结节数量和大小。
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转移性结直肠癌中对KRASG12D药理学抑制的旁路：EMP1+到LGR5+细胞状态转换
A Plastic EMP1+ to LGR5+ Cell State Conversion as a Bypass to KRASG12D Pharmacologic Inhibition in Metastatic Colorectal Cancer
实验完整度
高包含体外类器官模型、体内小鼠转移模型、单细胞RNA-seq、ATAC-seq、Hi-C、CUT&RUN、SLAM-seq等多层级验证，并进行了功能验证（遗传消融Lgr5+细胞）和机制验证（β-catenin/TCF活性调控）。
主要模型
AKTP小鼠肿瘤类器官（MTO）及肝转移模型 APK CRISPR工程类器官（CTO） KRASG12D患者来源类器官（PDO131和C31M） BRAFV600E患者来源异种移植类器官（PDXO CTAX91和CTAX127）
重点核对
RMC-9945治疗起始时间：d15、d21或d25；剂量100 mg/kg，口服，每日一次。 RMC-9945体外浓度：100 nmol/L；MRTX1133浓度：1 µmol/L。 DT消融剂量：25 μg/kg，隔日一次或每日一次，共6天或2周。 Lgr5-DTR-EGFP报告系统用于消融Lgr5+细胞。 使用4-OH-tamoxifen（1 µmol/L）诱导nTCF4-ERT2阻断β-catenin/TCF活性。
摘要
致癌基因KRAS的抑制剂有望治疗转移性结直肠癌（mCRC）。在本研究中，我们展示了一种选择性、共价的小分子抑制剂RMC-9945，靶向活性（ON）构象的RAS-G12D，在早期肝转移的临床前结直肠癌模型中发挥持久的疾病控制，但其治疗活性在晚期转移性疾病中减弱。RMC-9945治疗的转移灶经历了从与不良预后相关的Emp1+转录状态向WNT驱动的Lgr5+干细胞样状态的转变，该状态能在缺乏RAS-G12D活性时存活。这种细胞状态改变在RAS(ON)抑制剂治疗后数小时内发生，通过转录因子使用的转变，涉及有限的染色质重塑。通过RAS-G12D抑制将转移细胞强制转化为Lgr5+状态，随后对该群体进行遗传消融，在小鼠mCRC模型中减少了转移负担并延长了生存期。总体而言，这些临床前发现证明了致癌KRAS在控制mCRC细胞可塑性中的核心作用。意义：我们表明，在晚期mCRC的临床前模型中抑制致癌KRAS的获益有限，主要由于肿瘤细胞回复到干细胞样状态。我们的发现强调了致癌KRAS突变的上下文依赖性效应，并强调了细胞可塑性作为治疗机会。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在转移性结直肠癌中，KRASG12D抑制的耐药机制是否涉及肿瘤细胞状态的可塑性转换，以及该转换的分子基础是什么？
- 核心机制
- KRASG12D活性通过AP1转录因子维持EMP1+ HRC状态并抑制WNT驱动的LGR5+ CSC程序；抑制KRASG12D导致AP1活性降低，TCF/LEF转录因子占据增强，从而驱动EMP1+向LGR5+细胞状态转换，介导耐药。
- 主要证据
- RMC-9945处理肝转移模型后，scRNA-seq显示EMP1+细胞减少而LGR5+细胞增多；体外和体内实验证实RMC-9945上调Lgr5+ ISC程序并下调EpiHR程序；ATAC-seq和Hi-C显示AP1和TCF/LEF结合位点的动态变化；TOP报告基因实验表明β-catenin/TCF活性增加。
- 研究意义
- 研究揭示致癌KRAS通过调控细胞可塑性介导治疗耐药，提示联合靶向LGR5+ CSC状态可能提高KRASG12D抑制剂的疗效，为mCRC治疗策略提供新思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析细胞状态变化
揭示RMC-9945治疗后转移灶的转录状态重塑。
对d21开始治疗的小鼠肝转移灶进行scRNA-seq，分析细胞状态变化，比较EMP1+ HRC和Lgr5+ CSC的比例和基因表达。
体外类器官模型验证细胞状态转换
在体外模型中验证RMC-9945诱导EMP1+到Lgr5+的转换。
用AKTP MTOs、APK CTOs和PDOs处理RMC-9945，通过RT-qPCR、RNA-seq和活细胞成像（dOPM）观察细胞状态变化和生长动力学。
研究染色质和转录因子动态
探索KRAS抑制后细胞状态转换的表观遗传机制。
结合ATAC-seq和Hi-C分析Emp1和Lgr5基因座的可及性和三维结构，使用ChromBPNet和CUT&RUN识别转录因子结合位点变化。
验证β-catenin/TCF活性依赖
证实Lgr5+ CSCC状态依赖β-catenin/TCF转录活性。
使用TOP-luciferase报告基因检测β-catenin/TCF活性，并通过nTCF4-ERT2显性负性TCF阻断实验评估RMC-9945诱导的CSC程序的依赖性。
遗传消融Lgr5+细胞验证功能
确定Lgr5+ CSC状态在耐药中的作用，并评估联合治疗的潜力。
使用Lgr5-DTR-EGFP标记的AKTP MTOs，结合DT消融和RMC-9945治疗，评估转移负担和生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | RMC-9945 | -- | -- |
| 药物处理 | MRTX1133 | MedChemExpress | HY-134813 |
| 恩考芬尼 | MedChemExpress | HY-15605 | |
| 西妥昔单抗 | MERCK | 658752 | |
| 细胞培养 | Cultrex基底膜提取物2型 | Cultrex | 3533-005-02 |
| TrypLE表达酶 | Life Technologies | 12604039 | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | 12634028 | |
| HEPES | Gibco | 11560496 | |
| Glutamax | Gibco | 11574466 | |
| 不含维甲酸的B-27添加剂 | Gibco | 12587-010 | |
| 重组人EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| 加鲁尼瑟替尼 | -- | LY2157299 | |
| 基质胶 | Corning | 356255 | |
| Y27632 | -- | -- | |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML | |
| 4-羟基他莫昔芬 | Merck | H7904 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo | Promega | G7571 |
| 报告基因检测 | 荧光素酶检测系统 | Promega | E1500 |
| RNA提取 | PureLink RNA小提试剂盒 | Life Technologies | 12183025 |
| 单细胞RNA纯化试剂盒 | Norgen | 51800 | |
| cDNA合成 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Life Technologies | 4368813 |
| RT-qPCR | PowerUp SYBR Green 预混液 | Applied Biosystems | 15350929 |
| QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA-seq | Illumina NextSeq 2000 P3测序仪 | Illumina | -- |
| scRNA-seq | Chromium控制器 | 10X Genomics | -- |
| Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10X Genomics | PN-1000075 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| SLAM-seq | 4-硫代尿苷 | Carbosynth | -- |
| TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596026 | |
| QuantSeq 3' mRNA文库制备试剂盒FWD | Lexogen | -- | |
| NovaSeqX测序仪 | Illumina | -- | |
| ATAC-seq | Tn5转座酶 | Illumina | 20034197 |
| MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | 28004 | |
| Hi-C | MboI限制酶 | NEB | R0147M |
| T4 DNA连接酶 | NEB | M0202M | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 65601 | |
| Bioruptor Pico超声破碎仪 | Diagenode | B01080010 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7645L | |
| CUT&RUN | H3K27ac抗体 | Abcam | ab177178 |
| JunB抗体 | Cell Signaling Technology | 3753 | |
| pAG-MNase融合蛋白 | Cell Signaling Technology | 0366S | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | E7645L | |
| 免疫荧光 | 抗tdTomato抗体 | SICGEN | AB8181 |
| 抗E-钙粘蛋白抗体 | Abcam | ab15148 | |
| 抗活化β-连环蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| RNAscope | RNAscope LS 2.5探针 - Mm-Lgr5 | ACD Bio-Techne | 312178 |
| RNAscope 2.5 LS试剂盒-红色 | ACD Bio-Techne | 322150 | |
| 流式细胞术 | APC抗EPCAM抗体 | BioLegend | 118214 |
| BV-605抗CD45抗体 | BioLegend | -- | |
| BD FACSAria Fusion流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 活体成像 | IVIS-Spectrum小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- |
| 组织学 | NanoZoomer-2.0 HT C9600数字切片扫描仪 | Hamamatsu Photonics | -- |
| Olympus ScanR显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | C57BL/6J小鼠年龄（7-8周）、性别匹配；注射细胞数量（1×10^5）；注射方式（脾内注射）。 阅读提示：Methods: Mouse Splenic Injections |
| RMC-9945治疗 | 给药剂量（100 mg/kg）、给药方式（口服灌胃）、给药频率（每日一次）、治疗起始时间（d15/d21/d25）。 阅读提示：Methods: In Vivo Treatments; Figure 1A |
| 体外类器官治疗 | RMC-9945浓度（100 nmol/L）、处理时间（48小时等）、培养基成分（BME比例等）。 阅读提示：Methods: In Vitro Treatments; MTO Culture |
| Lgr5+细胞消融 | DT剂量（25 μg/kg）、给药频率（隔日或每日）、治疗时间点（d21或d15）。 阅读提示：Methods: In Vivo Treatments; Figure 7B |
| 报告基因检测 | TOP-luciferase构建体转染、RMC-9945处理时间、检测方法。 阅读提示：Methods: MTO TCF-Luc |