达科为行健雅实验室用 Cytek 全光谱流式仪 Aurora(DEMO 机) 对健康人的外周血样本进行 CD4 和 CD8 T 细胞及相关亚群，调节性 T 细胞（Tregs），γδ T 细胞，NKT 细胞，B 细胞，NK 细胞，单核细胞，嗜碱性粒细胞，固有淋巴细胞（ILCs）以及树突细胞的 25 色分析实例。

整个 panel 全部为表面标记，所用抗体均是 BioLegend 的，无需固定和破膜染色，方案简单易行，轻松实现 25 个荧光素的同时标记。

抗体预滴定处理，Panel 可直接使用。
 

样本类型：健康人的 EDTA 抗凝全血

仪器：Cytek Aurora 5L

实验 Panel：
 

实验设置：

样本管实验流程：
 

准备流式管，并做好相应的标记

1、每管加入 75μl 抗凝全血。

2、每管中分别加入 5μl 的 Human TruStain FcX(BioLegend Cat #422301)，混匀并室温避光孵育 10 minutes。

3、加入 75ul 混合物，包含预滴定后的抗体，True-Stain Monocyte Blocker(BioLegend Cat #426101)，以及 Brilliant Stain Buffer Plus（单染管不包含此 buffer），混匀后，室温避光孵育 20 minutes。

4、把 10X 的红细胞裂解液 (BioLegend Cat #422401) 用去离子水配制成 1X 工作液，使用前室温平衡。每管加 2 mL 的 1X 的红细胞裂解液，立即轻柔地混匀，室温避光孵育 15 minutes。

5、350 g 离心，5 minutes，弃上清。

6、用至少 2 mL 的 Cell Staining Buffer（BioLegend Cat #420201）洗一遍，350 g 离心，5 minutes，弃上清。

7、用 0.5 mL Cell Staining Buffer 重悬染色后的细胞，上机检测分析。

 

实验结果：
 

本次实验结果来自于达科为行健雅实验室
 

数据解析：
 

首先，利用 FSC-A/H 去除细胞粘连，CD45 圈出白细胞后，再对淋巴细胞、单核细胞和粒细胞群体进行进一步的分析。

嗜碱性粒细胞（Basophils）

嗜碱性粒细胞作为粒细胞中的一员，在骨髓中发育成熟，参与固有免疫和适应性免疫。

从 Total cells 中圈出嗜碱性粒细胞（CD45intCD123+CD11C+HLA-DR-）。

单核细胞（Moncytes）

CD45/SSC-A 圈出单核细胞，采用 CD14 和 CD16 来区分非经典单核细胞（CD14-CD16+），经典单核细胞（CD14+CD16-）以及中间型单核细胞（CD14+CD16+/low）。

淋巴细胞（Lymphocytes）

利用 CD3 和 TCRγδ 圈出三群细胞，其中 CD3+TCRγδ+用于分析 γδT 细胞，CD3-TCRγδ-用于分析 NK 细胞，树突细胞，B 细胞以及固有淋巴细胞，CD3+TCRγδ-用于分析 T 细胞，NKT 细胞。

γδ T 细胞（γδ T cells）

γδT 细胞是免疫系统中独特的组成部分，具有抗感染、抗肿瘤等功能，在 CAR-T 治疗中也发挥着重要的作用。

可以从 CD3+TCRγδ+的细胞群体中来分析 γδT 细胞亚群。

NKT 细胞（NKT-Like cells）

从 CD3+TCRγδ-中圈出 CD56+细胞，用于分析 NKT 细胞（CD3+CD56+）, 根据 CD57 的表达情况将 NKT 分为 3 群。

CD4 T 细胞/CD8 T 细胞

从 CD3+TCRγδ-的细胞群中，采用 CD4/CD8 来圈出 CD4+T 细胞和 CD8+T 细胞。再进一步从 CD4+T 细胞中分析 Tregs 细胞和 CD4+T，CD8+T 细胞的各个亚群。

调节性 T 细胞（Regulatory T cells）

调节性 T 细胞（Treg）在维持免疫稳态和免疫耐受方面都有着重要作用，是一类可以调节其它多种免疫细胞功能的 T 细胞亚型。

从 CD4+T 细胞中采用 CD25 和 CD127 圈定 Tregs（CD4+CD25+CD127lo/-），再看 CD27、CD38、HLA-DR 和 CD45RA 表达的相对量。

CD4/CD8 T 细胞各亚群

使用 CD45RA 和 CCR7，可将 CD4/CD8+T 细胞分为 Naïve：初始（CD45RA+CCR7+），CM：中央记忆（CD45RA-CCR7+），EM：效应记忆（CD45RA-CCR7-）以及 TEMRA：末端效应记忆（CD45RA+CCR7-）亚群。加入 CD27 和 CD28 可以进一步细分：

Naïve（CD45RA+CCR7+CD28++CD27++），CM（CD45RA-CCR7+CD28+CD27++），EM（CD45RA-CCR7-CD28+/-CD27+/-）以及 TEMRA（CD45RA+CCR7-CD28-CD27-）。

还有一些其他表面的 marker，如免疫检查点 PD-1、与细胞凋亡有关的 CD95  以及可作为 T 细胞活化的标志物 CD38 和 HLA-DR。

NK 细胞（NK cells）

NK 作为淋巴细胞群中的一员，在固有免疫系统中扮演着重要的角色。

从 CD3-TCRγδ-细胞中采用 CD16 和 CD56 来区分出成熟的 NK（CD16+CD56+），早期 NK（CD16-CD56+）以及终末 NK（CD16+CD56-）。CD57 可作为 NK 细胞成熟的标志物，识别具有强大细胞毒性和降低复制潜能的细胞。

树突细胞（Dendritic cells）

树突细胞是功能最强大的抗原提呈细胞，在免疫体系中发挥着至关重要的作用。

从 CD3-TCRγδ-细胞中先圈出树突细胞（CD19-CD56-CD14-HLA-DR+），然后识别出 pDCs（CD123+）和 CD11c+DCs。

固有淋巴细胞（Innate lymphoid cells，ILCs）

固有淋巴细胞来源于共同淋巴样祖细胞，包括多个细胞亚群，参与机体抗感染免疫，组织修复及炎症和肿瘤的发生等。

从 CD3-TCRγδ-的细胞中，采用 CD19 和 CD11c 圈出 CD19-CD11c-的细胞群体用于分析 ILCs。通过层层分析可圈出 ILCs（CD45+Lin-CD127+），其中 Lin 包括 CD3、TCRγδ、CD19、CD11c、CD123、CD14、HLA-DR、CD16、CD4、CD8。

B 细胞（B cells）

B 细胞来源于骨髓中的造血干细胞 (HSCs)，主要通过分泌抗体参与体液免疫。从 CD3-TCRγδ-的细胞中，采用 CD19 和 CD1c 圈出 B 细胞（CD19+CD1+）。以 IgD 和 CD27 进一步圈出 Naïve B cells（IgD+CD27-），Marginal zone-like（IgD+CD27+）和 Memory B cells（IgD-CD27+）。

 

我们又通过 Denovo 的流式软件 FCS Express 7 进行 tSNE 分析：

 

行健雅实验室服务平台以流式实验服务为主，目前可承接流式多色（包括样本处理，胞内染色、核内染色）、LEGENDplex 多因子、细胞凋亡、ROS/钙流、ELISA、ELISPOT 等实验技术服务。