前言

 

2022年2月，上海市农业科学院食用菌研究所鲍大鹏研究员课题组在《Frontiers in Microbiology》期刊发表的题为“Oxidative Stress and Autophagy Are Important Processes in Post Ripeness and Brown Film Formation in Mycelium of Lentinula edodes”的研究成果，通过iTRAQ标记定量蛋白组学、GC-MS非靶向代谢组学等技术对香菇菌丝进行定量蛋白质组学和代谢组学分析，发现氧化应激和自噬是香菇菌丝后熟转色重要过程，并对其在蛋白质组和代谢组水平上的分子机制有了新的认识。

 

 

中文标题：氧化应激和自噬是香菇菌丝后熟转色形成的重要过程

发表期刊：Frontiers in Microbiology

影响因子：5.64

作者单位：上海市农业科学院食用菌研究所

涉及的欧易/鹿明生物服务产品：iTRAQ标记定量蛋白组学、GC-MS非靶向代谢组学

 

研究背景

 

香菇一直被用于烹饪和医药，它们含有许多营养和生物活性化合物，比如香菇多糖是一种重要的抗肿瘤药物。香菇培育周期长，包括四个不同的阶段：营养菌丝生长、菌丝后后熟转色(BF)形成、原基和子实体的发育。其中菌丝后熟转色形成至少需要2个月，是原基发生前的重要阶段，其也影响香菇的产量和品质的重要阶段。但是香菇菌丝后熟转色的遗传机制研究比较少，本研究在组学水平上对香菇菌丝后熟转色的生物学机制进行系统分析。

 

研究思路

 

 

实验方法

 

(1)研究材料：菌包表层菌丝生长后30、45、60和75天取材

(2)蛋白组学测定：iTRAQ标记定量蛋白组学

(3)基于液相色谱-质谱/质谱法的肽分离和定量蛋白质组学分析

(4)差异表达蛋白的基因本体论注释与生物信息学分析

(5)Westernblot和定量PCR验证iTRAQ蛋白组数据

(6)代谢物提取和气相色谱-质谱法：GC-MS非靶向代谢组学

(7)透射电镜术

 

研究结果

 

棕色薄膜形成

 

通过在4个不同时间（菌丝生长后30、45、60和75天）检测后熟和BF形成过程中的形态特征，发现菌丝体逐渐发展为BF，并伴随着从第45天到75天的L∗（亮度）值逐渐下降(图1A)。如图1B所示，菌丝在无光照的30天内呈白色，并开始菌丝后熟和BF形成阶段。大部分菌丝在第60天形成BF，在光照射下在第75天完成转色基本完成。

 

图1 | 光照下（12h暗/12h光照下75天）香菇表面菌丝L*值（平均±SE，n=5）的变化及菌丝发育时棕色膜形成的表征

 

褐膜形成过程中菌丝体的蛋白质组学表达模式

 

为了研究蛋白质组变化的时间过程，作者测定了4个不同时间内上调和下调蛋白的数量。采用基于iTRAQ标记定量蛋白组学方法来获得与后熟后和BF形成相关的蛋白质组学变化的总体视图。在这四个阶段的样品中，总共产生了150,867个质谱。积累增加的阈值倍数变化截止值为2.0倍，如Venn图(图2B)所示，三组（2-1、3-1和4-1）中共有75个DEPs。组2-1和3-1组共享98个DEPs，组2-1和4-1组共享92个，组3-1和4-1组共享94个。两个样本中不同蛋白质之间的相关性相对较好（补充图2）。因此，当有BF的样品（45、60和75天）与没有BF的样品（30天）进行比较时，有许多DEPs，并且一些关键的DEPs是共同的。

 

图2 | 参与香菇褐膜形成的差异表达蛋白(DEPs)

 

差异表达蛋白的功能注释和分类

 

将三个实验组的DEPs合并，利用生物信息学进行分析，确定相关通路。在生物过程(BP)中，注释了188个蛋白，153个GO术语富集。在类别细胞成分(CC)中，192个蛋白质被注释，27个GO术语被富集。在分子功能类别(MF)中，注释了191个蛋白，并富集了139个GO术语。图3A显示了每个类别中前10个显著丰富的术语（在第6级）。在BP中，肾脏代谢过程是最具代表性的术语(P=8e-04)，其次是一系列代谢过程和对ROS的年龄依赖性反应、液泡遗传、脂质氧化、饥饿反应的固定相维持、核-液泡连接组装、过氧化物酶体裂变和线粒体裂变。因此，一些主要的BP术语与氧化应激反应和自噬有关。

 

在CC中，15.9%的DEPs属于线粒体类别(P=0.0389)。在MF中，氧化石墨烯的催化活性占主导地位。在KEGG分析中，大多数代谢途径显著富集，包括长寿调节途径-多个物种(图3B）。如图3C所示，线粒体裂变、膜裂变和对ROS的年龄依赖性反应也显著富集。KEGG分析显示，长寿调节途径-多物种也是最具代表性的途径(P=3.38e-03；图3D)。这些结果表明，线粒体形态、衰老和ROS的变化在BF形成的生理过程中起着重要作用。

 

图3 | 对(A，B)香菇褐膜形成过程中75个差异表达蛋白的239个和(C，D)75个差异表达蛋白(DEPs)的生物信息学分析

 

Westernblot和定量PCR验证iTRAQ蛋白组数据

 

为了验证iTRAQ标记蛋白组学分析测定的蛋白积累变化，选择两种蛋白进行westernblot分析。如图4A所示，iTRAQ分析中两种蛋白(RPD3和VMA3)的积累每次均与westernblot数据一致。RPD3、TOR1、VMA3和VAC8在基因水平上的相对表达量与蛋白水平相似，在BF的菌丝中也表达上调(图4B-D)。VAC8在2－1、3－1、4－1组的基因水平上高度上调。这些结果表明，这些上调的表达蛋白可能是香菇BF形成的重要蛋白。

 

图4| iTRAQ蛋白质组鉴定蛋白在香菇褐膜形成过程中的积累模式的验证

 

转色过程的代谢组学

 

为了三个对照组间聚类的总体概述，作者对GC-MS全谱代谢组学数据进行主成分分析。在PCA评分图(图5B)中，主要模型参数为三个主成分，R2X=0.539和Q2=0.414。r2X值表明该模型可靠，适用于解释三组间的代谢差异。4个样品之间明显分离，表明在成熟后和BF形成过程中存在代谢差异。此外，在PLS-DA(R2X=0.924，R2Y=0.881和Q2=0.771)中，来自不同时间的4个样本也被分离(图5C)，强烈表明了代谢的变化样品之间的过程。因此，气相色谱-质谱可以检测到的代谢物有很大的差异。

 

图5 | 香菇棕色膜形成过程中代谢物显著变化维恩图及BF形成过程中代谢谱主成分分析和偏最小二乘判别分析评分图

 

转色过程中代谢的时间依赖性

 

为了进一步确定BF形成过程中各代谢物的时间依赖性模式，作者发现甘露醇和海藻糖含量最高在30天，酪氨酸含量最高45天，麦芽糖和葡萄糖含量最高60天，二甘油含量最高75天，具有相似反应模式的代谢物聚集在一个树的两个主要类群中。第1组包括甘露醇、海藻糖、异亮氨酸、亮氨酸、l-苹果酸、o-琥珀酰基高丝氨酸、琥珀酸、苯丙氨酸、缬氨酸、4-氨基酸、6-磷酸葡萄糖酸、脯氨酸、苏氨酸、赖氨酸和马来酰亚胺。组1的代谢物在30天时含量丰富，但随后从45天下降到75天。组2主要包括双甘油、氧脯氨酸、-甘露基甘油、D-（甘油1-磷酸）、瓜氨酸、谷氨酸、肌醇、谷氨酰胺、D-谷糖和葡萄糖。与30天的水平相比，第2组代谢物的水平从45天到75天显著升高。此外，第2组代谢物酪氨酸、鸟氨酸、磷酸盐和麦芽糖的水平在第45天开始升高，然后在第75天显著下降。双甘油从60天增加到75天，明显是第2组代谢物。因此，这些代谢物可作为香菇BF形成的潜在生物标志物。

 

图6 | 香菇BF形成的潜在生物标志物

 

菌丝成熟和棕色膜形成过程中的活性氧和自噬

 

蛋白质组学和代谢组学联合分析数据表明，ROS和自噬在成熟后和BF形成过程中被激活。ROS检测显示过氧化氢水平逐渐升高。随着BF的形成，在第60天达到最高水平。此外，在透射电镜中观察到自噬体样结构。细胞核、液泡、高尔基体、线粒体和细胞壁都很容易区分(图7A-D)，在45、60和75天观察到自噬的特征特征。空泡化发生迅速，在第60天，空泡数量增加(图7C)。细胞膜从细胞壁收缩，出现膜泡（图7B-D）。在第75天，在一个较大的液泡中观察到一个含有可循环成分的自噬小体(AP)(图7d)。此外，每个细胞中空泡和自噬体的平均数量在60天时最高。因此，在可能由ROS诱导的细胞中，可以明显地观察到自噬的特征。

 

图7 | 无棕色膜及培养物超薄切片的透射电镜图像

 

研究结论

 

本研究以香菇菌丝为模型系统，采用蛋白质组学、代谢组学和透射电镜来表征香菇菌丝BF形成过程中ROS积累和自噬的变化。本研究的数据表明，自噬是香菇菌丝发育过程中的一个重要过程。基于这些发现，作者提出了一个构成香菇菌丝发育和自噬的潜在细胞事件的级联反应。饥饿和衰老作为诱导香菇菌丝细胞氧化应激的信号，导致线粒体分裂、膜裂变、过氧化物酶体裂变和脂质氧化。ROS猝灭物质的减少，包括甘露醇和海藻糖，以及ROS刺激物质，包括肌醇和葡萄糖的增加，会触发ROS爆发，并促进4-氨基酸的自噬。同时，氨基酸代谢也促进了mTOR诱导的自噬（核-液泡连接和调节线粒体自噬）。在这一过程中，去乙酰化酶RPD3也可能参与其中，并最终通过自噬促进营养物质的再循环、色素沉着和原基的起始。因此，本研究提高了对香菇菌丝后熟转色形成和子实体启动的自噬依赖机制的认识，同时也强调了自噬在香菇发育中的重要作用。

 

本研究利用标记定量(iTRAQ)蛋白质组学、基于气相色谱-质谱的代谢组学GC-MS非靶向代谢组学和透射电镜分析细胞结构，研究了香菇菌丝后熟转色形成的机制，并且首次证明氧化应激和自噬过程是至关重要，为后续进一步的研究提供了新的见解。
 

文末看点

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