前言

 

2021年5月，包括中央民族大学质谱成像与代谢组学实验室的再帕尔·阿不力孜教授科研团队在内的多个团队（一作：王中华）在Acta Pharmaceutica Sinica B期刊发表的题为 “Spatial-resolved metabolomics reveals tissuespecific metabolic reprogramming in diabetic nephropathy by using mass spectrometry imaging ”的研究成果，通过空间分辨代谢组学研究方法，发现了糖尿病肾病（DN）组织中代谢物的特异性，探究了糖尿病肾病（DN）机理，同时开发新的治疗策略，为糖尿病（DM）研究提供了理论依据。

 

 

中文标题：利用基于质谱成像的空间分辨代谢组学揭示糖尿病肾病中具有组织异质性的代谢重编程

研究对象：大鼠

发表期刊：Acta Pharmaceutica Sinica B

影响因子：11.413

发表时间：2021.05

联合发表单位：中央民族大学，中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所

运用生物技术：空间分辨代谢组学

 

研究背景

 

作为糖尿病（DM）的主要并发症，糖尿病肾病（DN）已成为终末期肾病（ESKD）的主要病因，对人类健康构成严重威胁，世界范围内糖尿病肾病的发病率越来越高。然而，DN发病机制的详细代谢机制仍不清楚。DN组织特异性代谢重编程的详细知识对于更准确地理解分子病理特征和开发新的治疗策略至关重要。尽管基于高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）和核磁共振（NMR）的代谢组学研究极大地增强了我们对糖尿病肾病的理解，但通过HPLC‒MS和NMR技术分析同质生物样本，如尿液、血清和肾组织匀浆等，几乎无法获得有关糖尿病肾病代谢产物空间分布的信息。

 

在本研究中，提出了一种基于气流辅助解吸电喷雾电离（AFADESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）集成质谱成像（MSI）的空间分辨代谢组学方法，来研究高脂饮食喂养和链脲佐菌素（STZ）治疗的DN大鼠肾脏组织特异性代谢改变，以及黄芪甲苷IV（AST，一种潜在的抗糖尿病药物）的治疗效果。

 

研究思路

 

 

研究方法

 

图1 | 使用气流辅助解吸电喷雾电离（AFADESI）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）集成质谱成像（MSI）对糖尿病肾病（DN）进行空间分辨代谢重编程的研究方案。

 

研究结果

 

生理、生化和组织病理学分析

 

图2展示了肾脏重量、肾脏/体重比以及H&E染色肾组织的代表性显微照片。DN组的肾脏重量和肾脏/体重比明显高于对照组（图2A和B）。H&E染色肾组织的组织学检查显示DN组大鼠的肾脏肥大和肾小球增大（图2C和D）。与DN组相比，高剂量AST组（H-AST）的肾脏/体重比显著降低，肾脏组织学损害也有所改善。这些生物学和病理学改变表明，未经治疗的糖尿病大鼠出现肾损伤，高剂量AST对这些动物的肾脏具有保护作用。

 

图2 | Control组、DN组、L-AST组和H-AST组肾脏样本信息

（A）肾脏重量

（B）肾脏/体重比

（C）整个肾脏切片的H&E染色图像

（D）肾皮质放大20倍H&E染色图像

 

MALDI-MSI技术观测代谢物在肾皮质中的分布情况

 

如图3所示，进一步对Control组和DN组大鼠的肾脏切片进行MALDI-MS分析，主要观测代谢物在肾皮质的分布情况。例如，m/z= 786.5315处的磷脂酰丝氨酸（PS（36:2））仅分布于肾小球，m/z =762.5103处的磷脂酰醇胺（PE（38:6））分布于肾小球周围，m/z =346.0567处的一磷酸腺苷AMP分布于皮质的其他区域。因肾皮质富含肾小球，易受糖尿病肾损害，而成像结果揭示了鉴别代谢物在肾皮质的一个精确分布。

 

图3 | 部分物质MALDI-MSI质谱图像

（A）肾皮质的H&E染色图像,黑圈表示肾小球

（B）一磷酸腺苷（AMP）成像图

（C）磷脂酰醇胺（PE（38:6））成像图

（D）磷脂酰丝氨酸（PS（36:2））成像图

（E）B、C和D的合并图像

 

AFADESI-MSI成像技术研究糖尿病大鼠肾脏中的糖代谢途径紊乱

 

图4展示了参与葡萄糖代谢的代谢物的空间分布和变化。葡萄糖是肾脏的主要能量底物，肾脏利用了体内大约10%的葡萄糖。葡萄糖的代谢途径在肾脏的不同区域有所不同。在本研究中，对照组的肾外髓质中观察到最高浓度的葡萄糖，这可能是因为该区域广泛吸收和利用葡萄糖，而钠-葡萄糖共转运蛋白（SGLT）主要分布在该区域。DN大鼠肾皮质葡萄糖水平显著升高，这与系统葡萄糖含量的增加相一致。然而，DN大鼠肾外髓质的葡萄糖水平显著低于对照组大鼠。此外，DN大鼠肾外髓质葡萄糖6-磷酸和甘油醛3-磷酸水平显著高于对照组大鼠。这些结果表明，在肾外髓质中存在葡萄糖的过度利用和葡萄糖进入糖酵解途径和磷酸戊糖途径（PPP）的代谢流量增加。

 

葡萄糖也可以通过山梨醇脱氢酶代谢产生山梨醇，糖尿病大鼠肾皮质和髓质内的山梨醇水平也显著升高。山梨醇的积累表明，葡萄糖代谢通量增加，进入肾脏的多元醇途径，据报道，这与DN的发病机制有关。

 

图4 | AFADESI-MSI成像技术研究Control组和DN组肾脏中参与葡萄糖代谢途径的代谢物

图注：W:全肾切片; C:肾皮质; OM:肾外髓质; IM:内髓质; Control:对照组; DN:糖尿病肾病组; PPP: 磷酸戊糖途径；Polyol pathway: 多元醇途径 ；Glycolysis: 糖酵解；

 

AFADESI-MSI成像技术研究糖尿病大鼠肾脏中的三羧酸（TCA）紊乱

 

TCA循环中涉及的空间代谢物分布和变化如图5所示。柠檬酸和苹果酸是TCA循环中众所周知的中间产物。与对照组大鼠相比，糖尿病肾病大鼠体内的维生素E水平显著降低。琥珀酸是TCA循环中的另一种重要中间体，也是琥珀酸脱氢酶（SDH）的底物，SDH是线粒体膜电子传递链的一部分，可以催化琥珀酸形成富马酸。DN大鼠肾外髓质的琥珀酸水平高于对照组大鼠。DN大鼠肾脏中与TCA循环相关的氨基酸水平，包括谷氨酰胺、天冬氨酸、苏氨酸和亮氨酸/异亮氨酸，也显著降低。这些TCA中间产物和TCA循环相关代谢物的紊乱表明DN大鼠肾脏SDH活性降低和线粒体功能障碍，已被确定为几种糖尿病并发症发生的重要因素。

 

图5 | AFADESI-MSI成像技术研究Control组和DN组肾脏中参与TCA循环代谢途径的代谢物

 

AFADESI-MSI成像技术研究糖尿病大鼠肾脏中核苷酸代谢中断

 

参与核苷酸代谢的空间代谢物分布和变化如图6所示。AMP（一磷酸腺苷）、ADP（二磷酸腺苷）和GMP（单磷酸鸟苷）主要分布于对照组大鼠的肾外髓质。然而，在糖尿病状态下，这些代谢物的分布模式发生了显著变化。在糖尿病状态下，AMP和GMP在肾外髓质的水平显著降低，但在肾皮质的水平显著升高。而ADP和ATP（三磷酸腺苷），在糖尿病大鼠的肾皮质和外髓质中观察到它们的水平显著增加，表明这些区域的ATP周转加快，这可能与肾脏功能亢进有关，例如肾小球滤过率Na和水的吸收增加，以及转运Na/K的ATP酶泵活性的改变，这就是糖尿病状态的一种表征。

 

肌苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿酸和尿苷是AMP、GMP和一磷酸尿苷（UMP）的分解代谢产物，主要分布在对照组的肾皮质，DN大鼠肾脏中这些代谢物的水平趋于降低，表明AMP、GMP和UMP分解代谢减少。

 

图6 | AFADESI-MSI空间代谢组学成像技术研究Control组和DN组肾脏中参与核苷酸代谢途径的代谢物

图注：W:全肾切片; C:肾皮质; OM:肾外髓质; IM:内髓质; Control:对照组; DN:糖尿病肾病组;

 

AFADESI-MSI成像技术研究糖尿病大鼠肾脏中脂质代谢的失调

 

如图7所示，再在这项研究中，作者观察到与脂质稳态相关的各种代谢物水平和空间分布的变化，包括DN大鼠肾脏中的脂肪酸、溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）、溶血磷脂酰甘油（LysoPG）、磷脂酸（PA）、二酰甘油（DAG）、磷脂酰胆碱（PC）、PE、PS和鞘磷脂（SM）。

DN组肾皮质油酸浓度显著升高，多不饱和脂肪酸（PUFA）的水平，包括亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸（DPA）（图7B2-B7），主要分布在对照组的肾皮质，在糖尿病状态下肾脏的不同区域趋于降低，排除肾外髓质中的DPA。结合已有文献研究表明油酸水平升高和多不饱和脂肪酸水平降低表明DN大鼠的肾脏可能发生了增加的肾脏炎症。

作者观察到，在DN组中，DAG（18:1/18:1）、DAG（18:1/18:2）、PC（32:0）、PC（34:1）、PC（36:2）、PC（36:1）、PC（38:4）、PC（38:5）和LysoPC（16:0）在肾切片上大量沉积，尤其是在外髓质（图7B8-B15和B23）。结合已有文献研究表明脂质在肾脏中积聚，并与肾小球硬化和肾小管间质损伤有关，可能与脂质代谢基因的功能失调有关。

DN组肾外髓质中的LysoPG（18:1）和LysoPG（20:4）水平显著升高，肾皮质和外髓质中的LysoPG（22:6）水平显著降低（图7B24-B26）。此外，仅分布于肾皮质的PA（P-34:2）/PA（O-34:3）水平在糖尿病组也显著降低（图7B16）。结合已有文献研究表明LysoPG和PA水平的改变可能导致CL的病理性重塑，这被认为是线粒体功能障碍相关糖尿病的病因。

DN大鼠肾脏中PE（P-38:6）、PE（38:6）、PE（38:4）、磷酰醇胺和甘油基磷酰醇胺的水平显著降低（图7B17-B19、B27和B28）。然而，DN大鼠肾外髓质的PE（36:4）水平显著升高（图7B20）。结合已有文献研究表明肾脏PE水平的改变可能导致电子传递链复合物活性、呼吸能力和线粒体ATP生成减少。

DN大鼠肾脏的PS（36:2）水平显著降低（图7B21）。如图3，我们知道PS（36:2）只在肾皮质的肾小球中分布。PS（36:2）在肾小球中的特异性分布表明，PS（36:2）可能在糖尿病肾小球硬化中发挥重要的生物学作用，这可能是糖尿病肾病的一个新的治疗靶点。

Control组的SM（d18:1/16:0）主要分布在肾皮质，但DN组的肾皮质和外髓质显著增加（图7B22）。结合已有文献研究表明SM（d18:1/16:0）在肾皮质和外髓质的积聚可能抑制AMPK活性，并有助于脂质沉积。

 

图7 | AFADESI-MSI空间代谢组学成像技术研究Control组和DN组肾脏中参与脂质代谢途径的代谢物

（A）脂质代谢的简化概述

（B）Control组和DN组肾脏中参与脂质代谢途径的代谢物

 

AFADESI-MSI成像技术研究糖尿病大鼠肾脏中的肉碱稳态障碍

 

如图8所示，在对照组的皮质和外髓质中检测到高强度的L-肉碱和短链酰基肉碱，包括乙酰肉碱和酰基肉碱C4:0，但在DN组的肾皮质中显著降低（图8A和C）。长链酰基卡尼汀，包括酰基卡尼汀C14:0、酰基卡尼汀C16:1、酰基卡尼汀C16:0、酰基卡尼汀C18:1和酰基卡尼汀C18:0，主要分布在对照组的肾外髓质，但在DN的肾脏中显示出显著的蓄积（图8D-H）。肾脏肉碱谱的改变可能与DN中线粒体酸氧化功能障碍和三羧酸循环活性的改变有关。

 

图8 | AFADESI-MSI成像技术研究Control组和DN组肾脏中L-卡尼汀及其衍生物的变化

 

研究结论

 

结合AFADESI-MSI和MALDI-MSI的优势，提出了一种空间分辨代谢组学方法来研究糖尿病肾脏的区域特异性代谢改变以及AST对DN的治疗效果。AFADESI-MSI鉴定了大量与DN相关的代谢物，并显示了它们在大鼠肾脏中独特的空间分布模式，而MALDI-MSI的加入提高了AFADESI检测到的代谢物的空间分辨率。结果表明，DN大鼠肾脏糖酵解和PPP活性增加、线粒体功能障碍、AMPK抑制、脂质代谢紊乱、肉碱、氧化还原（附件）和渗透平衡破坏（附件）均以区域特异性方式发生。通过反复口服黄芪甲苷IV（100 mg/kg）12周，这些区域特异性代谢紊乱得到改善。

 

本研究为糖尿病大鼠肾脏组织特异性代谢重编程和分子病理特征提供了更全面、更详细的信息。新发现的肾小球特异性鉴别代谢产物PS（36:2）可用于定位肾小球和寻找DN的肾小球特异性生物标志物。这些发现强调了AFADESI和MALDI整合的基于MSI的空间代谢组学方法在代谢性肾脏疾病中的强大作用。

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