mBio | 利用基因组技术评估华东地区12年间病猪大肠杆菌的耐药性

近期，浙江省农科院畜牧兽医所与中国科学技术大学生命科学学院的研究团队在期刊《mBio》上发表研究。该研究基于基因组技术，分析了中国东部地区12年间收集的114株病猪源大肠杆菌的耐药性，并首次发现了同时携带mcr-1和mcr-3基因的产肠毒素大肠杆菌（ETEC）菌株。

畜牧养殖和医疗中对抗生素的不当使用，催生出了带着“超级耐药基因”的耐药菌到处传播（如bla_NDM、mcr-1、tet(X4)）。削弱了“终J抗生素”的疗效，且新药匮乏，问题非常严重。

大肠杆菌作为重要人畜共患病原体，既能致病又能跨生态传播耐药基因（如携带高危基因bla_NDM-5、mcr-1、tet(X4/X5)）。其高毒力与多重耐药性叠加加剧风险。当下全基因组测序（WGS）是解析耐药性及致病基因的关键技术，为防控动物及人类相关疾病提供依据。

1. 本研究中大肠杆菌的流行率

从图1A可以看出：研究分析了2010-2021年间浙江11市82个猪场病/死猪来源的114株大肠杆菌，这些猪患有腹泻、脾肿大、肝肿大等疾病。

如图1B所示，基因组分析显示：共发现39种序列类型（ST），其中ST88（占15.8%）最常见，绍兴和杭州的ST多样性最高。不同年份和城市均有多种ST共存，部分ST型（如ST88）在9年间持续流行，而另一些（如ST117、ST48）则只在特定时段出现。菌种鉴定结果可靠，菌株间较小的SNP差异提示可能存在跨猪场、跨时间的传播。

图1. 114株大肠杆菌分离株的流行特征

图A：浙江省采样分布及时间（蓝色标记）

图B：菌株与城市、年份、高危耐药基因的关联，线条粗细对应菌株数量；

图C：基于MLST构建最小生成树，节点大小代表菌株量，分支长度反映基因差异。

结论：浙江病猪源大肠杆菌呈现高度遗传多样性（39种ST型），但菌株间微小的基因差异同时提示存在跨猪场传播风险，其中ST88型菌株表现出长达9年的持续流行能力。

图2. 114株大肠杆菌分离株的ANI

2010–2017年分离的大肠杆菌菌株名称以蓝色标记，2018–2021年分离的大肠杆菌菌株名称以粉色标记。

2. 114株大肠杆菌分离株的耐药性分析

114株病猪源大肠杆菌普遍呈现严重多重耐药（99.12%耐3类以上药（图3B）），对氨苄西林及复方制剂耐药率达100%，环丙沙星、四环素耐药率超94%（图3A）。值得注意的是，21.05%菌株耐粘菌素。2018年后粘菌素耐药率（15.71%）较前期（29.55%）显著下降（如图3C所示，2018-2021年），但F苯尼考耐药率升至94.29%，其他药物耐药率相对稳定。这种动态变化可能与用药政策调整相关。

图3. 114株大肠杆菌分离株的耐药性

图A：114株菌对13种抗生素的耐药率； 图B：多重耐药菌的分布；

图C：对比2010-2017年与2018-2021年两个时间段菌株的耐药率变化，并采用卡方检验分析差异显著性。

结论：浙江病猪源大肠杆菌普遍存在严重多重耐药性，其中粘菌素耐药现象突出，但2017年禁用后其耐药率显著下降，而F苯尼考耐药率反升，这种动态变化与用药政策调整密切相关。

3. 大肠杆菌分离株AMR相关基因组特征的表征

研究发现，114株病猪源大肠杆菌平均携带4.9个质粒，其中IncFIB质粒最常见（78.07%菌株）。所有菌株均含至少2种耐药基因(ARGs)，80.7%菌株含10种以上ARGs，以mdf(A)、tet(A)、floR、sul2基因最为普遍。关键发现是特定质粒与耐药基因存在强关联（如IncHI2型与aadA2b/sul3/tet(A)，IncI2型与mcr-1），且实验证实IncI2质粒可有效介导mcr-1基因在菌株间转移。

图4. 114株大肠杆菌分离株获得性耐药基因预测结果

图5. 114株大肠杆菌分离株中ARGs与质粒复制子的相关系数

结论：病猪源大肠杆菌普遍携带多种质粒且耐药基因富集，其中IncI2型质粒被证实是介导关键耐药基因mcr-1水平转移的高效载体。

4. 大肠杆菌分离株毒力相关基因组特征的鉴定

研究发现，在分析的114株大肠杆菌中，所有菌株都携带至少一种毒力基因，近八成菌株携带至少10种毒力基因。其中，terC基因最为普遍（99.12%），其次是traT基因（81.58%）。其他关键毒力基因stb、sta1、stx2A、stx2B和astA的出现比例在24.56%到36.84%之间。分析发现特定菌株分型（ST型）与某些毒力基因显著相关：ST501型与stb和sta1相关，ST100型与astA和stb相关，而ST88和ST4214型则与stb、sta1、stx2A和stx2B相关。此外，astA和stb之间，以及stb、sta1、stx2A、stx2B之间也存在明显的共现关系。研究还鉴定出28株产志贺毒素的大肠杆菌（STEC）、43株产肠毒素大肠杆菌（ETEC）和1株产紧密素大肠杆菌（EPEC）。

图6. 114株大肠杆菌分离株毒力基因预测结果

红色标记的网格表示已知的大肠杆菌高危毒力基因，粉色标记的网格表示一般毒力基因。

结论：病猪大肠杆菌普遍携带多种毒力基因，特定菌株型别（如ST501/ST100等）与关键毒素基因显著关联，且成功鉴定出STEC、ETEC及EPEC等致病亚型。

5. 携带mcr-1和mcr-3质粒的基因组特征分析

从研究发现两株大肠杆菌同时携带mcr-1和mcr-3基因，这两个基因分别位于不同的质粒上：mcr-1位于结构简单、传播潜力高的IncI2型质粒上，而mcr-3则位于结构复杂多样、携带多种耐药基因的IncHI2型质粒上。

图7. 基于BLAST工具，对携带mcr和tet(X4)的质粒与已报道质粒的比较分析

结论：发现大肠杆菌中mcr-1和mcr-3基因分别位于结构简单（IncI2型）和结构复杂（IncHI2型）的质粒上，表明两者具有不同的耐药基因传播机制。

6. 携带tet(X4)质粒的基因组特征分析

研究发现，两株替加环素耐药大肠杆菌携带两种结构不同的tet(X4)质粒：小质粒p626A1-38K-tetX4（IncX1型，结构简单，含tet(X4)和floR）和大质粒p802A1-191K-tetX4（复合型，含tet(X4)及5种其他耐药基因）。两者均与已知流行质粒骨架相似，且tet(X4)周围存在含多种耐药基因和插入序列的可移动区域，提示高水平传播风险。

图8. mcr基因的遗传环境分析

A：质粒p204A1-223K-mcr3和p602A1-220K-mcr3中*mcr-3*基因的遗传环境；

B：质粒p204A1-63K-mcr1和p602A1-65K-mcr1中*mcr-1*基因的遗传环境。

结论：研究发现，替加环素耐药大肠杆菌携带的两种结构差异显著的tet(X4)质粒均具备与流行质粒相似的骨架特征，且基因周围存在可移动区域，表明其具有高水平传播风险。

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