ELISA使用指南|人IL-11定量分析酶联免疫检测试剂盒

IL-11 简介：

人的白介素11（IL-11）是一个多效性的细胞因子，最早从骨髓基质细胞株中分离得到。人IL-11的cDNA编码199个氨基酸的前体蛋白，该蛋白包含一个22个氨基酸的疏水信号肽。成熟的IL-11有178个氨基酸构成，没有潜在的糖基化位点。人的IL-11和小鼠的IL-11有88%的同源性。IL-11可由各种间充质细胞产生，细胞可能以转录前或转录后调节的不同调控方式产生IL-11，不同细胞并不完全一致。

人的IL-11可与IL-3, IL -4, IL -7, IL -12, IL -13, SCF, Flt-3 ligand和GM-CSF协同作用，促进造血干细胞的增殖。IL-11与IL-3，SCF和促血小板生成素协同作用可促进血小板和巨核细胞的生成。IL-11可促进红细胞生成，骨骼细胞的生长，淋巴细胞的增殖，甚至还能调节造血微环境。肺泡和支气管上皮细胞在炎性细

胞因子的刺激下可产生IL-11。IL-11可刺激破骨细胞的生长，刺激急性反性时相的相应产物的生长，同时IL-11可抑制脂肪的生成。

检测原理:

本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样本中IL-11的浓度。IL-11捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标本或参考品时，其中的IL-11会与捕获抗体结合，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。当加入生物素化的抗人IL-11抗体后，抗人IL-11抗体与IL-11接合，形成夹心的免疫复合物，其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。随后加入辣根过氧化物酶标记的亲合素。生物素与亲合素特异性结合，亲合素连接的酶就会与夹心的免疫复合物连接起来；其它游离的成分通过洗涤的过程被除去。最后加入显色剂，若样本中存在IL-11将会形成免疫复合物，辣根过氧化物酶会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测，读其450nm处的OD值，IL-11浓度与OD450值之间呈正比，通过参考品绘制标准曲线，对照未知样本中OD值，即可算出标本中IL-11浓度。

人IL-11定量分析酶联免疫检测试剂盒组成:

标本收集:

1.标本的收集请按下列流程进行操作；

A.细胞上清标本离心去除悬浮物后即可；

B.血清标本应是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血浆标本，推荐用EDTA的方法收集

D.若待测样本不能及时检测，标本收集后请分装，冻存于－20℃，避免反复冻融。

2.血清标本不应添加任何防腐剂或抗凝剂；

3.标本应清澈透明，检测前样本中如有悬浮物应通过离心去除。

4.请勿使用溶血，高血脂或污染的标本检测，否则结果将不准确。

注：人血清或血浆样本请用样本分析缓冲液做倍比稀释后再检测。

注意事项:

1.试剂盒请保存在2～8℃。

2.浓缩洗涤液因在低温下可能有结晶，请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液。

3.标准品复溶加样后，剩余部份请丢弃。

4.底物请勿接触氧化剂和金属。

5.加样时，请及时更换枪头，避免交叉污染。

6.严禁混用不同批号的试剂盒组份。

7.充分混匀对保证反应结果的准性很重要，在加液后请轻轻叩击边缘以保证混匀。

8.室温反应，请严格控制在25～28℃。

9.洗涤过程是至关重要的，洗涤不充分会使精确度下降并导致结果误差较大。

10.试验中标准品和样本检测时建议作双复孔。

11.加样过程中避免气泡的产生。

12.血清和血浆标本的检测时，检测抗体的孵育时间应适当延长。

检测前准备工作:

 1.试剂盒自冰箱中取出后应置室温（25-28℃）平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时于2～8℃保存。

2.将浓缩洗涤液用双蒸水或去离子水稀释(1份加19份水)。

3. 如有5×标准品稀释液用双蒸水或去离子水稀释(1份加4份水)。

4.标准品:按标签复溶体积用标准品稀释液复溶使IL-11终浓度达到2000pg/ml，室温反应，请严格控制在25～28℃，静置15~20分钟后轻轻混悬（建议抽吸几次）待彻底溶解，用标准品稀释液倍比梯度稀释后依次加入检测孔中。（标准曲线取七个点，最高浓度为2000 pg/ml,标准品稀释液直接加入作为0浓度.）

 

洗涤方法:

自动洗板机或人工洗板：每孔洗涤液为300ul，注入与吸出间隔15-30秒。最后一次洗板完成后将板倒扣着在厚吸水纸上用力拍干。

实验过程需自备的材料：

1.不同规格的加样枪及相应的枪头；   

2.酶标仪；

3.自动洗板机；                     

4.去离子水或双蒸水；

操作步骤:

1.通过计算并确定一次性实验所需的板条数，取出所需板条放置在框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。

2.建议设置本底较正孔，即空白孔,设置方法为该孔只加TMB显色液和中止液。每次实验均需做标准品对照并画出标准曲线。

3. 分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜封住反应孔，室温（25-28℃）孵育120分钟。对于血清血浆来说，一般含量极低，不建议检测血清血浆样本。如检测血清血浆样本，建议先加样本分析缓冲液50ul，再加样本，如检测超出范围，请先加50ul的样本分析缓冲液，再加入用标准品稀释液稀释后的样本50μl检测。请注意记录好样品的稀释倍数，此处加样量50ul相当于已稀释了2倍。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

5.加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，室温（25-28℃）孵育60分钟。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

7.加入亲和素连接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水纸上拍干。

9.加入显色剂TMB100ul/孔，避光室温（25-28℃）孵育20分钟。

10.加入中止液50ul/孔,混匀后即刻测量OD450值。

结果判断:

1.复孔值在20%差异范围内结果有效，复孔值平均后可作为测量值。

2.每个标准品或标本的OD值应减去本底校正孔的OD值。

3.手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

4.若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。

典型数值和参考曲线

人IL-11参考标准曲线

 

 

注意：本图仅供参考，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

灵敏度，特异性和重复性:

1.灵敏度：多次重复结果表明，最小检出量为28.4pg/ml。

2.特异性：与人的Cardiotrophin-1，CNTF，G-CSF，IL-6，LIF，Leptin，OSM没有交叉反应。

3.重复性：板内，板间变异系数均<10%.

参考文献:

1. Du, X.X. and D.A. Williams (1997) Blood 89:3897.

2. Yang. L. et al. (1996) Mol. Cell. Biol. 16:3300.

3. Elias, J.A. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22261.

4. Booth, C. and C.S. Potten (1995) Cell Prolif. 28:581.

5. Cherel, M. et al. (1995) Blood 86: 2534.

6. Neben, S. et al. (1994) Exp. Hematol. 22:353.