细胞培养那点事 | 细胞的正确处理方式

      核心原理：使用胰蛋白酶（Trypsin）等消化液水解细胞外基质和细胞间的连接蛋白，使细胞变圆、脱落。

       步骤：

1. 准备：预热PBS、胰蛋白酶消化液（Trypsin-EDTA）和完全培养基。

2. 吸弃旧培养基。

3. PBS清洗：加入适量PBS，轻轻晃动润洗整个细胞表面，然后吸弃。此步至关重要，用于去除血清（会抑制胰酶活性）。

4. 消化：加入适量胰蛋白酶消化液（刚好能覆盖细胞表面即可），轻轻晃动使其均匀覆盖。

5. 孵育：将培养瓶放回37℃培养箱中孵育1-3分钟。关键： 需在显微镜下密切观察，当大部分细胞变圆、边缘折光性增强、细胞间隙变大时即可终止（切勿消化过度！）。

6. 终止：加入2-3倍于胰酶体积的完全培养基（其中的血清可以有效抑制胰酶活性），用移液器轻轻、均匀地吹打培养瓶底部，使所有细胞脱落，形成单细胞悬液。

7. 转移与离心：将细胞悬液转移至无菌离心管中，800-1000 rpm离心3-5分钟。

8. 重悬与计数：弃去上清液，加入适量新鲜培养基重悬细胞团块，并进行细胞计数。

9. 分瓶：按所需比例（如1:3, 1:4）将细胞悬液分配到新的培养瓶中，补足新鲜培养基，轻轻摇匀。

10. 培养：放回培养箱中继续培养。传代后24小时内可镜下观察细胞贴壁情况。

六、细胞冻存

1. 准备冻存液：SERANA 无血清细胞冻存液  （WXQA100）4℃冷藏备用。

2. 消化细胞：取处于对数生长期的健康细胞，按传代方法消化、离心。

3. 重悬：用配置好的冻存液重悬细胞，调整密度至约5×10⁶ 至 1×10⁷ cells/mL。

4. 分装：将细胞悬液分装至无菌冻存管中（每管1-1.5 mL），拧紧管盖，并用封口膜密封。

5. 简易方法：将其放入-80℃冰箱过夜，然后迅速转移至液氮长期保存。

6. 记录：详细记录细胞名称、代次、冻存日期、存放位置等信息。

 七：细胞复苏

1. 准备：预热完全培养基，准备15mL离心管。

2. 快速解冻：从液氮中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，不断摇晃使其在1分钟内完全融化。

3. 转移：用酒精消毒冻存管后，在超净台中将细胞悬液转移至含5-10mL预热的完全培养基的离心管中

4. 离心：低速离心（800-1000 rpm，5分钟），弃去上清。

5. 重悬与培养：用新鲜培养基重悬细胞，转移至培养瓶中，放入培养箱。

 八、特殊处理：细胞接种（铺板）

用于实验（如药物处理、检测）时，需要将细胞接种到多孔板、培养皿或爬片上。

1. 按传代方法消化细胞并制备成单细胞悬液。

2. 进行细胞计数。

3. 根据所需细胞密度和孔板体积，用新鲜培养基稀释细胞悬液。

   • 例如：想在96孔板每孔接种5000个细胞，体积100μL。则需将细胞浓度调整为 5×10⁴ cells/mL。

4. 将稀释好的细胞悬液轻轻混匀，加入孔板中。

5. 加样后，左右前后“十”字轻轻摇晃板子，使细胞均匀分布。

6. 放入培养箱，让细胞贴壁（通常4-24小时后贴壁）。

常见问题与 troubleshooting

• 细胞不贴壁：消化过度；培养基pH不对；血清质量差；培养瓶表面不洁；支原体污染。

• 消化速度慢：胰酶活性失效；PBS清洗不彻底残留血清；消化液用量不足。

• 细胞状态差，颗粒多：支原体污染；培养基营养不足或pH不当；代谢废物积累（需及时传代或换液）。