是否所有类器官都必须消化成单细胞？

一、 为什么要消化成单细胞？

1.打破组织结构，去除死亡细胞

原始组织中含有大量的非细胞成分（如胶原纤维、血管、坏死组织等）和死亡细胞。直接培养会导致营养供给受阻，细菌滋生，甚至导致培养物污染。消化成单细胞或小细胞团可以去除这些干扰物，确保只有健康的活细胞参与培养。

2. 促进细胞间的自组装

类器官的核心特性是自组织能力（self-organization）‍。将细胞打散后，在三维基质（如Matrigel）中培养，细胞会利用自身的黏附分子（如E-cadherin）重新聚集，主动分化成特定的组织结构。这是模拟体内发育过程的必要步骤。

3. 利于高通量药物筛选

在药物敏感性检测中，需要将类器官铺在96孔板或384孔板中。只有当类器官解离成单细胞后，才能均匀地重新接种在微孔板中，以确保每个孔的类器官大小和数量基本一致，从而获得可靠的实验数据。

4. 保证传代的均匀性

传代时需要控制类器官的大小。如果不消化，类器官可能会无限增大，内部细胞因缺氧而死亡。消化成单细胞或小细胞团后，重新接种可以得到体积均一、生长状态一致的类器官。

二、 常用推荐的消化方法

举例子：主要针对实体肿瘤类器官（如结直肠癌、胰腺癌等）：

1. 预备工作

组织修剪

在超净台（Class II）中操作。使用手术刀或剪刀将组织切成小块，直径约为 1-3 mm³。尽量去除脂肪、坏死组织和结缔组织，以提高活细胞产量。

洗涤

用含抗生素的冷PBS或HBSS缓冲液清洗，去除血液和血管内皮细胞，降低细菌污染风险。

2. 主要关键消化步骤

• 酶混合物

一般使用含有胶原酶（Collagenase）、透明质酸酶（Hyaluronidase）和DNA酶（DNase）的混合液。胶原酶用于分解细胞外基质，DNA酶用于降解因细胞死亡释放的DNA，防止细胞粘连成大块。

• 消化条件
  温度：37°C

• 摇床摇动：帮助酶均匀接触组织。
  

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• 时间

通常为 15-45分钟。这是一个非常关键的时间点，不能过久，否则会严重损伤细胞表面受体，导致活性下降。

• 监控消化进度

每隔5-10分钟取少量样本观察。

单细胞：如果看到大量的游离细胞，说明消化过度，应立即终止。

小细胞团：

推荐的状态是观察到由 10-30个细胞组成的小细胞团，此时的消化最为理想。此时细胞还未完全失去细胞间的相互作用，但已经足够分散，利于后续的培养。

3. 终止与收集

加入基础培养基

加入含有10% FBS的冷基础培养基（DMEM/F12），以终止酶的作用。

离心：300-400g，5分钟，温度4°C，去除上清液

重悬：将细胞沉淀重悬于培养基中，进行细胞计数。通常要求活细胞数≥10^4且存活率>90%。

4. 接种培养

细胞筛网过滤（可选）

使用40µm或70µm的细胞筛网过滤，去除大块组织碎片，只保留单细胞或小细胞团。

Embedding

将细胞混悬液混合于Matrigel（或Geltrex）中，滴加至培养皿底部，待凝固后加入完全培养基。

培养条件：37°C，5% CO₂，定期更换培养基

 

 

 

三、 特别提示：什么时候不需要消化成单细胞？

需要注意的是，并非所有类器官都必须消化成单细胞。这取决于组织来源和实验目的：

3.1 正常组织类器官

（如小肠、胃）：通常需要消化成单细胞或单个隐窝（crypt）进行培养。

3.2 肿瘤类器官

（如胰腺癌、结直肠癌）：部分研究表明，直接将组织块直接嵌入基质中（不完全消化）‍可能更有利于类器官的形成，且结构更接近原发肿瘤。

3.3 胚胎干细胞

通常不建议完全消化成单细胞，而是保留小克隆（4-20个细胞），因为完全单细胞状态可能导致细胞状态改变。

四、 常见问题与解决方案

4.1 类器官生长缓慢或不形成？

可能是消化过度，导致干细胞被损伤。应减少消化时间或降低酶浓度。也可能是细胞密度太低，接种时细胞数不足。建议增加接种密度

4.2 类器官中心形成空洞？

这通常是由于细胞过度紧密排列，内部细胞因缺氧而死亡，形成空心结构。调整接种密度或检查培养基中的生长因子是否足量。

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