类器官培养体系中，细胞如何形成紧密的聚团（spheroid）？

引言：

北 京 基 尔 比 生物科技公司主营产品：

Kilby 多通道3D细胞培养系统，

Kilby Gravity 微超重力三维细胞培养系统，

动植物/微生物等地面重力环境模拟装置【可以定制】，

Kilby Bio类器官自重力摇床，

Kirkstall Quasi Vivo 类器官3D串联芯片灌注培养系统

（二） 处理办法（按“从根本到技术”顺序）

2.1 细胞质量控制

新鲜或低代数细胞：尽量使用1–3 代的原代细胞或 iPSC，避免长期传代导致黏附分子表达下降。

复苏后恢复：冻存细胞解冻后先在低粘附培养皿中培养12–24 h，让细胞恢复活力再进行聚团操作。

2.2 调整细胞密度

经验值：对大多数上皮类细胞，单孔（96孔）每孔 2 × 10⁴–5 × 10⁴ 个细胞即可形成 100–200 µm 的球形聚团。

密度梯度实验：先设定1 × 10⁴、3 × 10⁴、5 × 10⁴ 三个密度，观察聚团形成速率，选取最适密度。

2.3 优化培养基

·血清/血清替代：加入5–10 % 胎牛血清（或 B27、N2）可提供黏附因子。

·特定因子：对肝、肠、脑等组织，加入Wnt3A、Rspondin、Noggin 等信号分子可促进细胞自组织。

·pH 与渗透压：使用CO₂平衡培养箱，pH 维持在 7.2–7.4，渗透压保持在 280–300 mOsm。

2.4 选择合适的低黏附支撑

2.5 机械条件调节

·摇床/旋转培养：低转速（低剪切）可促进细胞碰撞而不致破坏聚团。【推荐下图——北京基尔比自重力细胞类器官孔板培养摇床】

制造商北京基尔比公司——多功能自重力细胞类器官孔板培养摇床

·间歇性轻敲：每12 h 轻敲培养瓶一次，帮助细胞重新聚集。

·避免过度搅拌：过快会导致细胞破裂，聚团形成反而受阻。

2.6 氧/营养供给

·控制聚团大小：一般不超过300 µm，以免中心缺氧。

·使用透气微孔板或微流控系统：提升氧扩散，减少核心坏死。

·定期更换培养基：每2–3 天轻柔更换，避免扰动聚团。

2.7 常见“快速检查”清单

1.细胞活力：活细胞染色（如CalceinAM）> 90 %？

2.培养基：血清/因子是否在有效期内？

3.表面处理：是否使用低黏附或已涂覆Matrigel/PEG？

4.密度：是否在推荐范围内？

5.机械条件：摇床转速、离心参数是否符合实验方案？

（三） 示例：肝细胞类器官

1.细胞准备

取2 × 10⁴ cells/孔（96孔低黏附微孔板），使用新鲜的原代肝细胞或 iPSC衍生肝前体。

2.细胞悬浮

将细胞重悬于含5 % FBS、10 ng/mL Wnt3A、50 ng/mL Rspondin1、10 ng/mL Noggin 的肝细胞培养基中。

3.聚团诱导

轻度离心150 g，3 min，使细胞沉入微孔底部。

放入37 °C、5 % CO₂培养箱，静置 24 h，细胞自行聚集形成球形。

4.培养与监测

每2 天轻柔更换 1/3 培养基，避免扰动聚团。

第5–7 天观察球径是否在 150–250 µm 范围；若过大，可在第 4 天进行轻度机械切割或分割。

5.功能验证

检测Albumin、Urea 产生；若水平低于对照，考虑补充肝特异因子（如 HGF）或调低培养密度。

（四）小贴士

4.1 孔板培养自重力摇床：减少细胞与培养容器壁的接触时间和机会，降低细胞贴壁的概率，细胞更倾向于在培养液中自由悬浮并相互聚集，从而有利于球体的形成。【推荐下图——北京基尔比——自重力细胞类器官孔板/器官芯片培养摇床】

磁性悬浮：通过磁场调控细胞在培养液中的位置，可实现无接触、快速聚集，适合对聚团大小有严格要求的高通量筛选。

微流控芯片：空气-液体界面提供持续氧气，适合需要长时间培养的大型类器官。Kirkstall Quasi Vivo 类器官3D串联芯片灌注培养系统

常规技巧：使用新鲜血清、保持培养基pH、避免低温、定期检查细胞形态，都是防止“聚团不成”的基础。

结语

细胞不聚团往往是“细胞状态 + 环境条件 + 机械支撑” 三方面的综合结果。通过 提升细胞活力、调节接种密度、补充关键因子、选用低黏附或微孔支撑、合理控制机械搅拌，大多数类器官培养体系都能实现稳定、均一的聚团。

若仍有困难，建议先从 细胞活力 与 培养基成分 两个最基础的环节排查，再逐步引入孔板重力摇床或器官芯片灌流等高级技术。祝你的类器官实验顺利！