详细步骤：人输卵管上皮细胞建立和长期维持3D生殖类器官

 

一、研究背景与核心优势

该方案旨在解决传统输卵管研究模型的局限性（如永生化细胞系缺乏分化细胞类型、无法研究癌症起始等问题）, 输卵管类器官技术突破了这些限制，能够在体外重建输卵管上皮的三维结构和生理功能，包含纤毛细胞和分泌细胞两种主要细胞类型，为研究生理、病理过程及卵巢癌起源提供了高度仿真的模型。

关键特征：

可在3周内从约5 cm³组织块扩增出高达1×10⁸个上皮前体细胞，类器官包含PAX8阳性分泌细胞和脱酪氨酸化微管蛋白阳性纤毛细胞，可通过激素（β-雌二醇+孕酮）或化学物质（双苯并氮杂䓬DBZ）分别富集分泌细胞或纤毛细胞，稳定传代至少20次无生长缺陷

二、技术原理

成功建立依赖Notch和Wnt信号通路的激活，培养基需持续添加：

• Wnt3a条件培养基（25%）

• R-spondin-1条件培养基（25%）

• Noggin（100 ng/mL）等关键因子

这些因子维持上皮前体细胞的干性和增殖能力，在撤除或添加特定诱导条件下可分化为成熟细胞类型。

三、完整实验流程（四大核心步骤）

本阶段目标：从手术标本中高效分离纯化输卵管上皮干细胞，并在2D条件下快速扩增至足够数量（约5天达70%融合），为后续3D类器官构建提供高质量种子细胞。

A1. 组织获取与预处理（关键2-3小时窗口期）

1. 样本来源与伦理

   • 组织类型：优先选择因良性妇科疾病（如子宫肌瘤、子宫内膜异位症）行子宫切除术时连带切除的输卵管组织，最大限度降低肿瘤细胞污染风险

   • 病理评估：每例样本必须经病理医师确认无恶性病变

   • 知情同意：获取患者签署的科研用途知情同意书

   • 伦理审批：实验需通过当地伦理委员会审查（如文中提到的Charité EA1/002/07或Kiel D631/24）

   • GMO合规：若使用L-Wnt3a等基因工程细胞系，需获得当地基因技术监管机构的批准

2. 运输与暂存

   • 手术离体后立即置于冰浴的ADF+++培养基中运输

   • 关键时间窗：必须在2-3小时内开始处理，否则细胞活性显著下降

   • 若无法立即处理，可将组织剪成小块后冻存于液氮（长期）或4℃短期保存（<6小时）

A2. 组织解离与清理（无菌操作台中）

3. 初步清洗

   • 将输卵管转移至10 cm细胞培养皿，用10 mL DPBS轻柔冲洗2-3次，去除血液、黏液和腹腔积液

   • 用无菌镊子固定组织，避免反复抓握上皮区域

4. 去除非上皮成分

   • 浆膜层（外膜结缔组织）

   • 血管束（可见的红色管状结构）

   • 肌层（较厚的平滑肌组织，尽量去除以减少成纤维细胞污染）

   • 使用11号或22号无菌手术刀，在解剖显微镜下精细剔除：

   • 技巧：沿输卵管长轴方向"片"状切削，而非"剪"断，可保持上皮完整性

5. 纵向剖开暴露黏膜

   • 用精细眼科剪从伞端至峡部全程纵向剪开，使黏膜皱襞完全展开

   • 再次用DPBS冲洗管腔，清除管腔内液体和脱落细胞碎片

A3. 上皮细胞采集（两种策略）

6. 首选方法：机械刮取（更高纯度）

   • 持手术刀与管腔表面呈45-60°角，用刀背或钝侧沿长轴方向单向刮取3-5次

   • 力度控制：中等力度，听到轻微"沙沙"声为宜，过度施压会带入基质细胞

   • 收集：每刮2-3次将刀尖上的乳白色糊状物用DPBS冲洗至15 mL Falcon管中

   • 优势：纯度>90%，显著减少成纤维细胞污染

7. 备选方法：组织微块消化

   • 若组织过软易碎（如妊娠期输卵管），改用精细剪将黏膜层剪成约 0.5 mm³ 的微小组织块

   • 注意事项：块越小消化越充分，但会损失部分细胞

A4. 胶原酶消化解离

8. 消化体系配置

   • 消化液：0.5 mg/mL I型胶原酶（Sigma SCR103）溶于ADF基础培养基

   • 推荐体积：每根输卵管使用10 mL消化液，确保组织充分浸没

   • 容器选择：使用25 cm²培养瓶而非离心管，可增加组织与酶接触面积

9. 消化条件优化

   • 消化终点：组织块边缘模糊，展开呈"云雾状"，单个细胞或细胞团游离

   • 过度消化：细胞碎片增多，存活率<70%

   • 温度：37℃恒温水浴或培养箱

   • 动态摇床：100-200 rpm持续摇动【或者使用北京基尔比生物Kilby 类器官精密灌注摆动式重力摇床，如下图】，关键！静态消化效率降低60%以上

     

      

   • 时间监控：标准45分钟，但需镜检判断：

   • 可视指标：消化充分时，浑浊度明显增加，肉眼可见絮状物消散

      

10. 终止消化与过滤

    • 直接加入等体积含5% FCS的ADF（无需加TrypLE抑制剂）

    • 过100 μm细胞筛网至0.1% BSA预包被的50 mL管中，去除未消化组织

    • 包被技巧：加入1 mL 0.1% BSA，旋转润洗管壁后弃去，防止细胞粘附

A5. 细胞洗涤与接种

11. 离心参数

    • 500×g，5分钟，25℃（室温即可，避免低温激活细胞应激）

    • 弃上清，保留约200 μL残液以防吸入细胞沉淀

12. 二次洗涤

    • 用10 mL ADF重悬，轻柔吹打5-8次（避免气泡）

    • 重复离心一次，彻底去除胶原酶和细胞碎片

13. 接种密度与培养基

    • 用FT isolation medium重悬沉淀，调整密度至1×10⁶ cells/mL

    • 接种于未经包被的T25培养瓶（上皮细胞可贴壁，基质细胞贴壁差）

    • 每瓶接种量：2 mL细胞悬液（约2×10⁶细胞）

14. 抗污染强化措施

    • 添加庆大霉素（10 μg/mL）和Fungin（0.1% v/v），前3天每天换液

    • 第4天起改用标准扩增培养基（含1% P/S）

A6. 2D培养监控与维护

15. 日常观察

    • Day 1-2：可见小簇状贴壁细胞，呈铺路石样形态

    • Day 3-4：细胞岛扩大，边缘清晰，无成纤维细胞混杂（呈梭形）

    • Day 5-7：达70-80%融合，准备转入3D

16. 换液策略

    • 第1-3天：每天换液，去除未贴壁细胞和碎片

    • 第4天起：每2天换液，避免过度消耗生长因子

    • 换液技巧：沿侧壁缓慢加入，避免直接冲击细胞层

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B. 3D类器官建立

B1. 准备工作（所有步骤冰上操作）

1. ECM融化

   • 提前12-24小时将Matrigel（Corning 354230）或Cultrex（R&D 3533-010-02）从-80℃移至4℃冰盒

   • 严禁在37℃水浴快速融化，会形成凝胶块

   • 融化后轻轻旋转混匀（避免涡旋），分装成200 μL或1 mL冻存管备用

2. 耗材预冷

   • 将所有离心管、移液枪头、24孔板（仅板底）置于-20℃预冷10分钟

   • 24孔板仅预热底部，加入细胞前37℃孵育30分钟（促进ECM快速聚合）

3. 离心机预冷

   • 设置4℃，至少提前30分钟开启

4. 试剂准备

   • ADF+++：冰上预冷

   • FT expansion medium：37℃水浴预热（使用前再加热，避免反复升温）

B2. 细胞消化与精确计数

5. TrypLE消化优化

   • 吸弃培养基后，用DPBS快速漂洗1次（去除FCS残留）

   • 加入2 mL TrypLE Express（Gibco 12605010），37℃孵育

   • 关键监控：每2分钟镜检，见细胞边缘变圆、细胞间连接松开即可终止

   • 标准时间：5-10分钟，切勿超过15分钟，会损害细胞表面受体

6. 细胞收集

   • 直接加入10 mL ADF+++（无需FCS中和，TrypLE非动物源）

   • 用P1000枪头轻柔吹打3-5次，避免过度剪切力

7. 离心参数

   • 300×g，7分钟，4℃（低温降低细胞代谢，减少损伤）

8. 精确计数与活率评估

   • 弃上清，用200 μL ADF++重悬

   • 使用自动细胞计数仪（含台盼蓝染色）或血球计数板

   • 合格标准：活率>85%，单个细胞占比>90%

   • 计算公式：所需细胞总数 = 25,000 cells/孔 × 总孔数

B3. ECM-细胞悬液配制（黄金比例）

9. 浓度标准化

   • 每孔：10 μL细胞悬液（含25,000 cells）+ 40 μL ECM = 50 μL微滴

   • 每板（24孔）：240 μL细胞悬液 + 960 μL ECM = 1,200 μL总量

   • 目标密度：25,000 cells / 50 μL ECM微滴 = 500,000 cells/mL（ECM中最终浓度）

   • 推荐配比：细胞悬液与ECM按 1:5体积比混合

10. 分步混合技巧

    • 先在15 mL管中加入冰ECM（如960 μL）

    • 再缓慢加入冰细胞悬液（如240 μL），边加边用预冷枪头轻柔吹打

    • 严禁反向操作（将ECM加入细胞悬液会导致局部浓度过高）

    • 混合后立即使用，放置超过5分钟会导致ECM提前聚合

B4. 微滴接种技术（稳定性关键）

11. 手法演示

    • 持P200枪头，垂直于孔中心上方约1 cm

    • 缓慢推动活塞，让液滴自由落体至孔底中央

    • 理想形态：形成**穹顶状（dome）**立体微滴，直径约5-6 mm

    • 避免：液体铺展过大（ECM过稀）或无法成滴（ECM过浓）

12. 板边缘处理

    • 边缘孔易蒸发，建议加入PBS或空白ECM填充，减少边缘效应

    • 或接种后用板盖密封膜包裹

B5. 固化与培养基覆盖

13. 固化参数

    • 37℃孵育30-45分钟，切勿晃动

    • 判断标准：微滴由半透明液态变为不透明凝胶状，倾斜板不流动

14. 培养基添加

    • 沿侧壁缓慢加入500 μL预热的expansion medium

    • 关键：枪头勿触碰ECM微滴，避免机械破坏

    • 培养基应室温平衡5分钟，避免温度冲击

15. 初期培养监控

    • Day 1-2：细胞在ECM中呈单个或小簇状

    • Day 3-5：形成5-10个细胞的致密团，开始出芽

    • Day 7-10：形成50-100 μm囊性结构，可见极性化

    • Day 14：成熟类器官，直径100-300 μm，可用于传代

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C. 长期传代与维持

C1. 传代时机判断（精准窗口）

1. 形态学标准

   • 最佳时机：类器官直径150-300 μm，囊腔明显，但未出现坏死核心

   • 过早传代（<100 μm）：细胞数量不足，传代后生长缓慢

   • 过晚传代（>500 μm）：中心细胞坏死，释放DNA导致ECM液化

2. 时间周期

   • 标准：14-21天传代一次

   • 高密度培养：可缩短至10-12天

   • 低密度培养：可延长至25天

C2. 完整传代流程（标准12孔/管）

3. ECM破碎

   • 用P1000枪头垂直刺入微滴中心，快速上下吹打3-4次

   • 技巧：每孔破碎后立即将悬液吸入同一15 mL管，避免ECM重新聚合

   • 收集量：每管不超过12孔（即6 mL ECM悬液），否则离心不充分

4. 第一次离心与洗涤

   • 破碎后每孔加入500 μL 冰ADF+++，用枪头吹打混匀

   • 收集至15 mL管，再补加ADF+++至总体积12 mL

   • 离心：300×g，5分钟，4℃

   • 观察：应见三层结构——上清（透明）、ECM层（白色胶状）、细胞沉淀（粉红）

   • 弃液：吸弃上清和大部分ECM层，保留约500 μL残液

5. TrypLE二次消化（核心步骤）

   • 包被方法：针筒内吸入0.1% BSA后推出，重复3次

   • 力度：中等速度，避免产生气泡

   • 每管加入1 mL TrypLE Express，用枪头充分重悬ECM-细胞混合物

   • 水浴：37℃，5分钟，摇晃水浴（50-100 rpm）显著提高消化效率

   • 机械破碎：用BSA预包被的18G钝针抽吸6-8次

6. 终止与二次离心

   • 立即加入11 mL冰ADF+++终止消化

   • 离心：300×g，5分钟，4℃

   • 关键：此时沉淀应为松散细胞团，而非紧密团块

C3. 重悬与再接种

7. 计数与调整

   • 弃上清，用200 μL ADF+++重悬

   • 无需精确计数，按经验比例传代（如1:5）

   • 活率要求：>80%

8. ECM再包埋

   • 常规扩增：25,000 cells/孔（50 μL微滴）

   • 高密度实验：50,000 cells/孔（观察细胞间相互作用）

   • 低密度克隆：5,000 cells/孔（研究单克隆起源）

   • 按 1:5比例 加入冰ECM（如200 μL细胞悬液 + 1,000 μL ECM）

   • 接种量调整：

9. 后续培养

   • 接种后第3天首次换液，之后每2-4天换液

   • 长期稳定性：至少20代无核型异常或生长衰退

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D. 冻存与复苏

D1. 冻存前准备（细胞状态优化）

1. 最佳时机

   • 形态：培养5-7天，类器官直径100-200 μm，处于对数生长期

   • 密度：24孔板中70-80%孔有类器官，避免过密

   • 时间：传代后第5天冻存，而非传代当天（细胞需恢复）

D2. 冻存流程（慢速冻存）

2. 消化与收集

   • 按C部分步骤1-6破碎ECM、消化、离心

   • 弃上清后，不清洗，直接保留细胞沉淀

3. 冻存液配制与重悬

   • 举例：48孔类器官 → 12 mL CryoSFM

   • CryoSFM（PromoCell C-29922）：无需稀释，直接使用

   • 配比：每4孔类器官用1 mL冻存液

   • 重悬：用枪头轻柔吹打，避免产生气泡

4. 分装与程序降温

   • 每支1.5 mL冻存管加入1 mL细胞悬液（含约3-5×10⁵个类器官碎片）

   • 立即转入预冷4℃的程序降温盒（如Mr. Frosty或CoolCell LX）

   • 程序：-80℃冰箱过夜（12-18小时） → 次日转入液氮气相2小时 → 投入液相长期保存

   • 标签：注明患者ID、 passage数、日期、细胞密度

D3. 复苏流程（快速复苏）

5. 复苏前准备

   • 提前融化ECM，预热24孔板，准备冰ADF+++

   • 水浴预热：37℃水浴锅调至最高水位，确保冻存管完全浸没

6. 快速解冻

   • 从液氮取出冻存管，立即投入37℃水浴

   • 关键时间：90-120秒内完全解冻，严禁超过2分钟

   • 判断标准：冻存液刚完全融化，但管壁仍感冰凉

7. 稀释与洗涤

   • 提前在15 mL管中准备11 mL冰ADF+++

   • 将解冻后的1 mL悬液逐滴加入ADF+++中，边加边轻摇混匀（降低渗透压冲击）

   • 离心：300×g，5分钟，4℃

8. 再接种优化

   • 弃上清后，用200 μL ADF+++重悬

   • 复苏密度：双倍接种密度（50,000 cells/孔），因部分细胞会死亡

   • ECM混合与接种同B部分

   • 关键补充：培养基中Y-27632浓度加倍至20 μM，持续3天，帮助细胞恢复

9. 复苏后监控

   • Day 1-2：观察碎片较多属正常

   • Day 3-5：应见新类器官形成，若未见则复苏失败

   • Day 7：恢复常规培养，Y-27632降回10 μM

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六、质量控制与常见故障

成功标志：

• 2D阶段：5天内达到70%融合，获得8×10⁶细胞

• 3D阶段：类器官呈囊性结构，边界清晰，直径100-500 μm（见图2-3）

常见问题：

1. 消化不足：组织块剪更小或延长胶原酶消化时间

2. ECM塌陷：确保ECM充分混匀，提高ECM:培养基比例

3. 无生长：检查条件培养基活性（可用Wnt报告基因细胞系验证），提高初始接种密度

4. 离心后ECM悬浮：使用冰PBS、BSA包被离心管、每管不超过12孔样本

全流程核心禁忌

1. 温度失控：ECM接触室温>5分钟即不可逆聚合

2. 消化过度：TrypLE>15分钟会降解Wnt受体（LRP5/6），导致类器官无法形成

3. 密度过低：<10,000 cells/孔会导致类器官形成效率<30%

4. 传代过晚：>25天传代会引发中心坏死，释放IL-1β导致整体死亡

5. 复苏过慢：>2分钟解冻会激活caspase级联反应，存活率<20%

   

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