细胞类器官培养简史: From Harrison to Kirkstall Quasi Vivo Organs-on-a-Chip

 

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一、关键词

细胞培养、二维细胞培养、三维细胞培养、类器官、球体、器官芯片

二、摘要

概述了细胞培养领域的历史里程碑，从19世纪80年代Wilhelm Roux的开创性实验，到Ross Granville Harrison在20世纪初的奠基工作，再到Alexis Carrel的永生化细胞研究。

后续Johannes Holtfreter、Aron Moscona、Joseph Leighton等推动了三维细胞培养发展，2006年Takahashi和Yamanaka诱导多能干细胞（iPSCs）的发现具有革命性意义。近年来，球体、类器官和器官芯片技术成为研究热点，文章还探讨了从二维到三维细胞培养的转变及未来方向。

三、细胞培养历史概述

1. 早期起源（19世纪末-20世纪初）

- Robert Koch（19世纪80年代）：改进微生物培养技术，使用明胶固化培养基，提出“科赫法则”，强调灭菌的重要性，与Richard Petri合作改进培养皿（Petri dish）。

- Wilhelm Roux（19世纪80年代）：通过鸡胚细胞实验，证明细胞可在盐溶液中在体外存活。

- Leo Loeb：在华盛顿大学开展细胞培养、移植和激素研究，为实验病理学奠定基础。

- Ross Granville Harrison（1906年）：在试管中培养蛙神经纤维组织，使用血块、盐溶液和琼脂作为培养基，开发“悬滴技术”，通过无菌操作（如灭菌手术器械）将细胞培养延长至5周，其著作《Observations on the Development of Living Nerve Fibers》具有重要意义。

2. 技术发展与突破（20世纪初-中期）

- Alexis Carrel：1912年诺贝尔生理学或医学奖得主，改进悬滴培养法，设计“卡雷尔培养瓶”，首次详细描述三维细胞培养（利用丝绸线培养组织碎片），与Charles Lindbergh合作，后者开发血清分离方法并引入耐高压的“Pyrex玻璃”器皿，成功培养出首个永生化鸡胚心肌细胞系。

- HeLa细胞系（1951年）：源于Henrietta Lacks的宫颈腺癌组织，由George Gay实验室培养成功，具有强增殖能力，至今仍广泛应用于研究。

- 三维培养技术先驱：

- Johannes Holtfreter：开发球形细胞聚集体培养方法，通过搅拌培养瓶促进细胞接触和营养扩散。

- Aron Arthur Moscona：利用锥形瓶持续搅拌培养细胞，防止细胞贴壁，促进三维细胞聚集体形成，开展细胞嵌合体研究。

- Joseph Leighton（20世纪50年代）：使用纤维素海绵三维基质培养细胞，证明三维培养更能模拟体内细胞行为。

3. 干细胞研究与突破（20世纪60年代-21世纪初）

- 骨髓干细胞研究：Ernst McCulloch和James Till（20世纪60年代初）通过骨髓细胞移植实验，提出“脾集落”概念，为骨髓干细胞定义奠定基础。

- 间充质干细胞研究：Alexander Friedenstein（20世纪60年代起）从骨髓中分离出“成纤维细胞集落形成细胞（FCFCs）”，即间充质干细胞的前身，证明其多向分化潜能。

- 胚胎干细胞：1981年，Martin Evans和Matthew Kaufman建立小鼠囊胚细胞系，Gail R. Martin首次使用“胚胎干细胞”术语。

- 人类胚胎干细胞：1998年，James Thomson团队从人类囊胚内细胞团培养出人类胚胎干细胞。

- 诱导多能干细胞（iPSCs）：2006年，Kazutoshi Takahashi和Shinya Yamanaka通过Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc四因子将成纤维细胞重编程为iPSCs；2007年，James Thomson团队使用Oct4、Sox2、NANOG、Lin28四因子获得人类iPSCs。

四、二维与三维细胞培养技术

1. 二维（2D）细胞培养

- 原理：细胞在平面贴壁表面（如培养皿、培养瓶）生长，通过特定涂层（如多聚赖氨酸、Matrigel、纤连蛋白）促进非贴壁细胞黏附。

-应用：用于研究细胞分化、迁移、生长等生理机制，广泛应用于癌症研究、毒性测试（如药物候选物评估），符合“3Rs”原则（减少、优化、替代动物实验）。

- 局限性：缺乏细胞与细胞外基质的接触，难以模拟体内细胞结构和生理特性，部分细胞系（如肝细胞）难以在二维环境中稳定培养。

2. 三维（3D）细胞培养

- 球体（Spheroids）：由细胞自组织形成的球形聚集体，无需预定义基质，可通过悬滴法、磁悬浮等方法制备，存在营养、氧气等梯度，核心易形成坏死区，适用于癌症模型研究。

- 类器官（Organoids）：比球体更复杂，由干细胞或分化细胞形成，具有自组织、多细胞性和功能性，可模拟器官发生和功能，应用于遗传疾病、肿瘤、药物研发等领域（如脑类器官研究小头畸形，肝类器官研究囊性纤维化）。

- 发展里程碑：1970年Robert Sutherland开发多细胞球体；1972年Tom Elsdale和Jonathan Bard使用胶原蛋白凝胶作为三维支架；1977年Matrigel被引入作为细胞外基质提取物。

- 局限性：缺乏功能性血管化，导致营养分布不均和坏死；结构组织与体内器官存在差异；操作复杂、成本高。

五、器官芯片（Organ-on-a-Chip）

- 原理：基于微流控系统，将三维细胞培养集成在芯片中，通过微通道实现细胞间相互作用，可模拟血管化、机械刺激和组织灌注。 例如英国Kirkstall Quasi Vivo多功能细胞类器官芯片

- 典型模型：

- 肺芯片（2010年）：由多孔膜分隔的两个微通道组成，分别培养肺泡上皮细胞和肺微血管内皮细胞，可模拟呼吸运动和肺部感染。

- 心脏芯片：基于人类iPSCs分化的心肌细胞，可模拟心脏收缩（频率55~80 bpm），用于药物评估。

- 脑芯片：模拟神经祖细胞迁移，用于神经发育和肿瘤研究。

- 肝芯片、肾芯片、胰腺芯片：分别用于评估肝毒性、肾毒性和研究囊性纤维化相关胰腺功能障碍。

六、细胞培养的新展望

- 人体芯片（Human-on-a-Chip）：整合多个器官芯片，通过微通道模拟全身生理相互作用，有望替代动物实验，用于系统生物学研究和药物测试。

- 挑战：缺乏通用细胞培养基；血管化技术尚未成熟；微通道设计需模拟体内血管特性。

- 应用前景：推动个性化 medicine 发展，加速药物研发，深入解析疾病机制。

七、结论

二维细胞培养为生物医学研究奠定了基础，但存在局限性；三维细胞培养（球体、类器官）和器官芯片技术通过模拟体内微环境，在临床前研究、药物筛选和再生医学中显示出巨大潜力，未来将进一步缩小基础研究与临床应用的差距。

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