基于纳米颗粒的微重力诱导骨质疏松症对策研究

一）研究背景与目的

- 骨质疏松症的机制：健康成年人的骨组织重塑由破骨细胞（骨吸收）和成骨细胞（骨形成）的协同作用完成，受局部、全身信号及外部刺激调控。失衡会导致骨质疏松，表现为骨量低、强度下降、微结构破坏，骨折风险增加。

- 微重力与骨质疏松：宇航员在微重力环境中，因肌肉骨骼系统机械应力减少，会出现骨丢失（俄罗斯和平号空间站宇航员每月骨量丢失1-2%，部分胫骨远端6个月丢失达25%），且返回地球后骨密度和强度仅部分恢复，长期太空探索可能带来更严重后果。

【地面模拟利器，Kilby Gravity系统的技术突破】

太空实验机会稀缺且昂贵，地面模拟微重力平台成为研究的关键支撑。北京基尔比生物科技公司的Kilby Gravity重力模拟控制装置提供了可及性强、精确度高的实验平台。

该系统核心技术在于三维随机旋转重力矢量分散机制。通过双轴独立控制旋转系统，使培养容器内的重力矢量在空间快速随机化，实现持续的10⁻³g微重力环境模拟——接近国际空间站的实际微重力水平。

北京基尔比生物科技公司的Kilby Gravity微重力培养系统的优势在于多功能集成与实时监控能力。设备内置传感器，可实时监控并可视化重力水平；旋转器主体紧凑设计可放入标准CO2培养箱，维持细胞培养的温湿度和气体环境。

- 现有对策局限：宇航员目前采用的剧烈运动、均衡饮食、补充维生素D等方法无法完全消除骨丢失风险，需开发药物治疗手段。

- 研究目的：探索含钙羟基磷灰石纳米颗粒（nCa-HAP）和含锶羟基磷灰石纳米颗粒（nSr-HAP）对微重力诱导骨质疏松的防治效果，评估其在1g重力、微重力模拟器模拟微重力及国际空间站（ISS）真实微重力环境中对人骨髓间充质干细胞（hBMMSCs）骨重塑的影响。

（二）实验材料与方法

2.1 纳米颗粒

- 前期已开发并化学表征了nCa-HAP和nSr-HAP，实验中使用牛血清白蛋白分散纳米粉体制备悬浮液，浓度测试后确定62.5μg/mL为适宜浓度（安全性和有效性最佳）。

2.2 细胞培养

- 细胞来源：人骨髓间充质干细胞（hBMMSCs），经表型分析符合国际细胞治疗协会标准。

- 培养基：

- 增殖培养基（PM）：低糖DMEM，含10%FBS、1%谷氨酰胺、50μg/ml青霉素-链霉素等。

- 成骨培养基（OM）：α-MEM，含10%FBS、50μg/ml青霉素-链霉素及成骨诱导剂（100nM地塞米松、5mMβ-甘油磷酸二钠、50mg/ml抗坏血酸）。

- 培养条件：37°C、5%CO₂湿润培养箱，根据实验需求在1g、RPM模拟微重力（88h，37°C，随机速度和方向）及ISS真实微重力环境中进行。

（三）实验设计

3.1 1g重力实验：检测细胞活力、增殖、凋亡、形态，以及成骨分化相关指标（碱性磷酸酶（ALP）活性、骨标志物基因表达、矿化基质沉积等），培养时间最长28天。

3.2 模拟微重力实验（RPM）：使用STROMA硬件实验单元（EU），评估nCa-HAP和nSr-HAP对hBMMSCs在88h模拟微重力下的ALP活性等影响，设置地面对照组（GC）。

3.3 ISS实验：15个Thermanox载玻片接种hBMMSCs，12个用于太空实验，3个用于前期评估。6个STROMA EU分别进行对照（#124、#125）、nCa-HAP处理（#126、#127）、nSr-HAP处理（#128、#129），于2015年4月14日由SpaceX CRS-6发射，4月18日开始实验，培养88h后处理样本，返回地球后分析。

（四） 检测方法

4.1 细胞活力与增殖：MTT法，在1、3、7、8、28天检测，测595nm和650nm吸光度。

4.2 凋亡检测：PSVue480染色，荧光显微镜观察。

4.3 形态学观察：共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），染色β-微管蛋白（绿色）和F-肌动蛋白（红色）。

4.4 ALP活性：比色终点法，测405nm吸光度，计算酶活性。

4.5 矿化检测：茜素红染色，4°C固定后染色， cetylpyridinium溶解后测562nm吸光度定量。

4.6 基因表达：qRT-PCR，检测成骨相关基因（ALP、COL1A1、COL3A1等），以18S为内参。

4.7 蛋白检测：ELISA法，检测细胞外基质蛋白（I型和III型胶原、骨桥蛋白等）。

4.8 晶体分析：显微镜成像，ImageJ软件分析羟基磷灰石晶体形态和大小。

（五）实验结果

5.1 1g重力条件下的结果

- 细胞活力与增殖：nCa-HAP各浓度在1、3天对细胞活力无显著影响；nSr-HAP在7天培养时，浓度达62.5μg/mL时促进细胞增殖（增加20-50%），且无凋亡迹象（与H₂O₂处理的阳性对照组对比）。

- 细胞形态：nCa-HAP和nSr-HAP处理后，细胞仍保持典型的成纤维细胞样形态，生长和生理黏附未受阻碍（光镜、TEM观察）。

- 成骨分化：

- ALP活性：在OM中，31.25和62.5μg/mL nSr-HAP处理组ALP活性显著高于对照组（p<0.01），nCa-HAP组无显著差异；28天时nSr-HAP组ALP免疫荧光更强。

- 矿化基质：茜素红染色显示，OM中nCa-HAP和nSr-HAP处理组钙沉积显著多于对照组（p<0.001），nSr-HAP组效果更优。

- 基因表达：OM中，nSr-HAP处理组ALP、DCN、RUNX2等成骨相关基因表达显著上调（p<0.001）；PM中，两种纳米颗粒均使COL1A1基因表达增加（p<0.001）。

- 蛋白沉积：ELISA和免疫荧光显示，OM中nSr-HAP处理组的I型胶原、骨钙素等骨基质蛋白沉积显著增加。

5.2 模拟微重力（RPM）条件下的结果

- RPM组成骨基因标志物表达显著低于GC组；nSr-HAP处理可对抗微重力引起的ALP活性降低，使其恢复至GC对照组水平，nCa-HAP无此效果。

5.3 国际空间站（ISS）条件下的结果

部分实验单元（#124、#126）受污染，RNA降解，无法进行转录组分析。 显微镜观察显示，ISS对照组晶体小于GC对照组（p<0.05）；ISS和GC中，nSr-HAP处理组晶体尺寸均显著大于nCa-HAP组和对照组（p<0.05），表明nSr-HAP在无重力下仍能促进细胞外基质矿化。

（六）结论与展望

6.1 nSr-HAP在1g条件下能加速hBMMSCs向成骨细胞分化，增加ALP活性、骨标志物基因表达及矿化基质沉积。 在模拟微重力（RPM）中，nSr-HAP可保护微重力引起的ALP活性降低；在ISS真实微重力中，能促进羟基磷灰石晶体沉积。

6.2 nSr-HAP具有作为骨替代合成材料成分、药物制剂添加剂或食品补充剂，向骨组织递送Sr并促进骨再生的潜力。

6.3 需进一步研究nSr-HAP激活的分子机制，包括对破骨细胞、骨细胞的影响及成骨-破骨细胞共培养体系的作用。 计划探究nCa-HAP、nSr-HAP及Sr²⁺在Wnt/β-连环蛋白通路中的可能参与（该通路与骨骼生物学和疾病相关）。后续将开展更多地面实验，以揭示成骨细胞活性背后的分子机制，为太空和地面骨质疏松治疗提供更充分的依据。

研究参与机构与实验概况

参与机构：帕维亚大学分子医学系、米兰大学药理与生物分子科学系、CNR结晶学研究所、Kayser Italia公司、意大利航天局等。

ISS实验概况：属于FUTURA太空任务，2015年4月发射，培养88h，使用STROMA EU和KUBIK培养箱，温度控制符合要求（37°C培养，-95°C储存），地面对照组同步进行相同操作。

北 京 基 尔 比 生物科技公司主营产品：

Kilby 全自动3D-clinostat 细胞培养仪，

Kilby Gravity 微/超重力三维细胞培养系统，

3D回转重力环境模拟系统，随机定位仪，

Kilby Bio类器官芯片摇摆灌注仪，

Kirkstall Quasi Vivo 类器官串联芯片3D培养仪

请联系我们，了解更多产品详情！