类器官应用于关节炎-肠道免疫轴研究

背景与研究现状

关节炎是一种常见且复杂的炎症性关节疾病，包括类风湿关节炎（RA）和脊柱关节炎（SpA）等多种类型，其发病与遗传、环境和微生物等多种因素密切相关。“肠 - 关节轴假说” 认为肠道和关节炎症通过免疫 - 微生物相互作用存在关联，但因果关系尚不明确。临床观察发现，部分 SpA 患者存在肠道炎症，且 IBD 患者中 SpA 的发病率较高；同时，肠道微生物群失调在关节炎患者中普遍存在，特定细菌与关节炎的发生发展有关 。

关节炎与肠道炎症之间的联系（即“肠道-关节轴”）近年来受到广泛关注。研究表明，肠道微生物组的失衡（如菌群失调）与关节炎的发生密切相关。肠道屏障功能的破坏可能导致细菌及其代谢产物进入系统循环，从而引发全身性炎症反应。此外，免疫系统的超敏反应也被认为是关节炎的重要驱动因素。

然而，目前的研究多集中于静态实验模型或动物模型，这些模型无法完全模拟人体复杂的动态生理和病理过程。肠道微生物群和肠道炎症在关节炎发病中的具体作用机制仍不清楚，且现有的研究模型存在一定局限性，难以准确模拟人体复杂的生理病理过程。

研究的新颖性

Kirkstall Quasi Vivo类器官串联芯片动态培养系统 是一种新兴的体外研究工具，能够模拟人体复杂的生理和病理过程。与传统的静态培养系统相比，动态培养系统能够更真实地模拟肠道和关节的微环境，同时通过串联设计实现肠道和关节类器官之间的实时交互。

这种技术不仅能够揭示肠道微生物组与关节炎症之间的动态关系，还能为研究免疫系统的超敏反应提供新的视角。通过动态培养系统，研究者可以实时监测肠道屏障功能、免疫细胞迁移以及炎症因子的分泌，从而为关节炎-肠道免疫轴的机制研究提供更精确的实验模型。

技术路线

（一）肠道类器官的制备

1.1 iPSC的获取与培养：从健康对照组或关节炎患者的体细胞（如皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞）中诱导产生iPSC。使用标准的iPSC培养基（如mTeSR1或Essential 8）在Matrigel包被的培养皿上进行培养，维持iPSC的多能性状态。

1.2 肠道类器官的诱导分化：

  定形内胚层（Definitive Endoderm, DE）诱导：将iPSC以低密度接种到Matrigel包被的培养皿中，形成胚胎体（Embryoid Bodies, EBs）。在含有100 ng/mL Activin A和10 ng/mL FGF2的培养基中培养3天，诱导iPSC向定形内胚层分化。

 中肠/后肠（Mid/Hindgut）诱导：更换为含有10 ng/mL Wnt3a、1 μM CHIR99021（GSK3β抑制剂）和10 ng/mL FGF4的培养基，培养3天，促进定形内胚层向中肠/后肠的分化。

1.3 肠道类器官的形成： 将分化后的中肠/后肠细胞嵌入3D基质（如Matrigel）中，加入含有N2补充剂、EGF、FGF2和R-spondin 1的培养基，促进肠道类器官的形成。在培养基中加入Retinoic Acid和CHIR99021，进一步促进肠道类器官的成熟。

1.4 肠道类器官的维持与功能验证：在含有N2补充剂、EGF、FGF2和R-spondin 1的培养基中长期培养肠道类器官。通过免疫荧光染色检测肠道特异性标志物（如CK20、CDX2）的表达，验证肠道类器官的分化效率。通过肠道屏障功能测试（如FITC-Dextran通透性实验）评估肠道类器官的屏障功能。

（二） 关节类器官的制备

2.1 iPSC的获取与培养：从健康对照组或关节炎患者的体细胞（如皮肤成纤维细胞或外周血单核细胞）中诱导产生iPSC。使用标准的iPSC培养基（如mTeSR1或Essential 8）在Matrigel包被的培养皿上进行培养，维持iPSC的多能性状态。

2.2 关节类器官的诱导分化：

 中胚层（Mesoderm）诱导：将iPSC以低密度接种到Matrigel包被的培养皿中，形成胚胎体（Embryoid Bodies, EBs）。在含有10 ng/mL BMP4和10 ng/mL Activin A的培养基中培养3天，诱导iPSC向中胚层分化。

软骨/滑膜（Chondrocyte/Synovium）诱导：更换为含有10 ng/mL FGF2和10 ng/mL TGFβ的培养基，培养3天，促进中胚层向软骨/滑膜前体细胞的分化。

 2.3 关节类器官的形成：将分化后的软骨/滑膜前体细胞嵌入3D基质（如Matrigel）中，加入含有TGFβ、BMP2和Insulin的培养基，促进关节类器官的形成。在培养基中加入Dexamethasone和Ascorbic Acid，进一步促进关节类器官的成熟。

2.4 关节类器官的维持与功能验证：在含有TGFβ、BMP2、Insulin、Dexamethasone和Ascorbic Acid的培养基中长期培养关节类器官。通过免疫荧光染色检测关节特异性标志物（如COL2A1、SOX9）的表达，验证关节类器官的分化效率。通过关节组织的机械性能测试和炎症因子分泌实验，评估关节类器官的功能。

（三）类器官串联芯片系统组装与动态培养

Kirkstall Quasi Vivo类器官串联芯片系统，包含独立的培养腔室，分别用于肠道类器官和关节类器官的培养。在两个腔室之间设置微流通道，模拟肠道和关节之间的循环系统。

将肠道类器官和关节类器官分别置于串联芯片的两个腔室中。通过微流控技术实现肠道和关节类器官之间的动态交互。在肠道类器官中引入特定的肠道微生物组或代谢产物，模拟肠道炎症环境。

在关节类器官中监测炎症因子的分泌、免疫细胞的迁移以及组织损伤情况。利用高分辨率成像技术观察类器官的形态变化和组织损伤。

（四）预期研究结果

1. 肠道微生物组对关节炎症的影响：预期发现特定肠道微生物组或代谢产物（如短链脂肪酸、色氨酸衍生物）能够通过肠道屏障进入系统循环，从而引发关节炎症。通过动态培养系统，揭示肠道微生物组与关节炎症之间的因果关系。

2. 免疫系统的超敏反应：预期发现免疫系统的超敏反应是关节炎的重要驱动因素，尤其是在无菌条件下仍能观察到关节炎症的发生。通过监测免疫细胞的迁移和活化状态，揭示免疫系统在肠道和关节炎症中的作用机制。

3. 治疗策略的验证：预期通过类器官串联芯片系统验证微生物组调节（如益生菌、益生元、粪菌移植）和免疫调节（如抗TNF-α、抗IL-17）治疗策略的有效性。为个性化治疗提供理论依据，区分微生物组依赖型和非依赖型关节炎亚型。

    

4. 揭示肠道 - 关节轴的作用机制：通过观察动态共培养过程中肠道类器官和关节类器官的变化，有望明确肠道微生物群及其代谢产物、肠道炎症等因素对关节类器官的直接影响，以及关节炎症是否会反馈调节肠道类器官的状态，从而揭示肠道 - 关节轴在关节炎发病中的具体分子机制 。

5.发现新的治疗靶点和生物标志物：分析不同实验组类器官的基因和蛋白质表达数据，可能发现新的与关节炎发病相关的分子靶点，为开发针对性的治疗药物提供依据。同时，筛选出能够反映关节炎病情进展的生物标志物，有助于实现关节炎的早期诊断和病情监测 。

通过上述方法，可以成功制备基于iPSC的肠道和关节类器官，并在Kirkstall Quasi Vivo类器官串联芯片动态培养系统 中模拟肠道和关节的相互作用，为研究关节炎-肠道免疫轴提供一个创新的实验平台。