细胞培养常见问题之液体培养基篇

干货知识分享：细胞培养常见问题之——液体培养基篇

培养基是一切体外培养的基础，为细胞的生长和代谢活动提供了各种必需的营养物质。关于细胞培养的常见问题，在上一篇的微文已经分享过血清篇了，想要了解的小伙伴可以去公众号主页搜索。今天给分享该系列的第二篇--经典液体培养基的介绍以及常见问题解答，快叫上你的实验搭子一起来看看吧~

01培养基的前世今生

根据培养基的来源和组成成分，它的发展经历了三个阶段，分别是天然培养基阶段、合成培养基阶段及无血清培养基阶段。

在20世纪50年代，当时体外培养普遍直接采用组织凝块、生物性液体和组织提取液，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸液等，这就是天然培养基阶段。由于天然培养基的使用会带来不可避免的病毒污染、批次间差异大等问题，于是就有了合成培养基，其主要成分包括生长因子、营养物质、缓冲剂、抗生素等。合成培养基最初的配方是MEM，由Eagle在1959年首次提出，之后经过不断发展涌出了各种不同配方的优质合成培养基，包括M199、DMEM、IMDM、PRMI1640等，这些经典培养基到现在依旧是实验室中应用最广泛的。

由于天然培养基的一些营养成分不能被合成培养基完全代替，一般需要在完全培养基中添加血清成分。在一些时刻血清的添加也同样面临了挑战，如因实验需要控制培养体系中的外源蛋白含量时、实验需要完全排除血清批间差异的影响时，另外血清昂贵的价格也使科研人员们不断寻求一种培养效果相同的全新方案。因此无血清培养基应运而生，目前已经发展到化学成分限定培养基阶段了。

当然用最多的还是一些经典的合成培养基，按照物理性质可将其分为:液体培养基、固体培养基、半固体培养基、脱水培养基。液体培养基最为常见，它具有可进行通气培养或振荡培养的优势，因为它的流动性便于精确控制培养基的溶液温度、营养浓度和气体含量等;它对细胞生长时的附着能力要求小，细胞可快速扩增;当需要大量细胞培养时也更经济高效。作为大家使用最为频繁的细胞培养试剂，基础液体培养基在细胞培养中起到关键作用。

02 基础液体培养基的组分

为满足细胞的生长需要，液体培养基一般都会含有水、能源物质、氨基酸、维生素、无机盐和pH指示剂等。还可能含有血清或血清替代成分。

>水

液体细胞培养基中90%以上是水。水的品质将直接影响细胞培养的效果。细胞培养用水须经过纯化，品质应符合中国药典注注射用水标准或者超纯水的标准。

>能源物质

液体培养基的能源物质以葡萄糖为主，少数含有半乳糖、果糖、甘露糖等。根据葡萄糖含量不同区分，代谢消耗较快的病理状态细胞多选用高糖(4.5g/L)培养基，单抗细胞融合时使用低糖(1.0g/L)培养基。当葡萄糖不足时，可以使用丙酮酸钠为细胞提供碳源，并且部分细胞系对丙酮酸钠具有依赖性。

> 氨基酸

氨基酸是蛋白质合成的基础，不同细胞需要的氨基酸类型具有差异性。谷氨酰胺是一种氨基酸，也是一种重要能源物质，但要注意它在溶液中不稳定，代谢产物会损伤敏感细胞系。

>维生素

维生素参与酶构成，是维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用。

>无机盐

无机盐的主要作用就是维持渗透压平衡，调节pH。

> 缓冲体系

细胞培养过程中造成培养基pH波动的主要物质是细胞代谢产生的CO2，液体培养基通常采用NaHCO3或HEPES缓冲体系来为细胞生长提供稳定的pH环境。

> 酚红:酸碱指示剂。

03 基础液体培养基的常见问题

Q1:液体培养基为什么颜色不一样?

A1:酚红加量不同，导致颜色差异：DMEM＞MEM＞DMEM/12＞RPM1640＞F12&F10

Q2:培养基放冰箱里颜色变深?

A2:空气中C02浓度低，培养基内C02会逐渐溢出，HCO3减少，造成培养基偏碱。

Q3:含有谷氨酰胺培养基的保存条件?

A3:谷氨酰胺对温度敏感，温度越高降解速度越快。谷氨酰胺在溶液中不稳定，单独保存应置于-20℃冰箱中。加有谷氨酰胺的液体培养基应存放在2°C-8°℃，或者购买不含谷氨酰胺的培养基使用时添加。

Q4:液体培养基可以放-20℃及以下保存吗?

A4:不可以。在-20℃下培养基中的盐容易析出，培养基融化后，有些盐无法重新溶解，从而导致渗透压降低。液体培养基放在2-8℃长期保存。液体培养基保存要避光。培养基中的某些成分遇光会产生过氧化氢，具有细胞毒性。

Q5:购买的液体培养基可以保存多久?

A5:理论上只要保存得当，保质期范围之内都可以用。但实际开瓶后保存时间过长会导致液体培养基中盐分的析出和pH值的改变，因此建议开瓶后尽快用完。

Q6:更换培养基后细胞长不好?

1)各厂家培养基配方并非完全相同，可能细胞已经适应当前的培养体系;

2)原代细胞更易适应新培养基，而传代细胞系更换比较难;3)刚复苏的细胞不要用来适应新培养基，细胞活率低，待状态稳定后再用来驯化;

4)敏感性细胞适应培养基，需要多驯化几代，期间细胞死亡数量减少，生长缓慢是正常现象。

Q7:DPBS和PBS有什么区别，能通用吗?

A7:都属于磷酸盐缓冲液，成分上只有一点点磷酸盐的含量差异，均有等渗和调节pH的功能，大多数对于细胞的使用上可以通用。

Q8:HBSS和PBS/DPBS有什么区别?

A8:HBSS缓冲液中盐成分较PBS和DPBS更复杂，且含有葡萄糖,能为细胞提供简单的营养,而PBS/DPBS不能提供营养。