NEB无缝克隆 --同源重组Gibson组装、Golden Gate 组装

NEB无缝克隆

--同源重组Gibson组装、Golden Gate 组装

 

北京云肽生物科技的美国进口NEB无缝克隆产品，提供基于同源重组Gibson组装(吉布森组装)的NEBuilder高保真无缝克隆试剂盒(含核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶)，以及基于Golden Gate 组装(金门组装)的NEBridge无缝克隆试剂盒(BsaI-HFv2、BsmBI-v2)、50种llS型限制性内切酶、T4 DNA连核酶等，支持≤52个片段的无缝组装，具备高组装效率、高灵活性，支持复杂DNA片段克隆，为生物实验分子克隆提供高性能的研究工具。

 

 

 

一、NEBuilder Gibson组装

NEBuilder无缝克隆技术，是对同源重组技术(即Gibson组装、吉布森组装)的升级，在待插入片段末端通过PCR扩增添加15~30bp重叠序列，在等温条件下，通过5'外切酶消化形成3’突出粘性末端，同源重组互补退火，高保真DNA聚合酶进行延伸，高保真DNA连接酶补平缺口，可实现≤11个片段的高效无缝组装，特别适合单链寡核苷酸ssOligo塔桥、文库构建、微型高通量克隆等应用。

 

 

 

 

 

 

 

 

NEBuilder拥有>10年的开发应用经验，性能指标严格，保证数据实现，具备高组装效率、高保真度，即可解决复杂的高端克隆应用，也可节省常规克隆后续筛选时间。

1、不依赖内切酶--只需在多个片段末端添加重叠序列，仅质粒载体线性化时需要酶切，不受限制性内切酶所限，具备更大灵活性。

2、高组装效率--支持≤11个片段的无缝组装。

3、高保真度--使用高保真DNA聚合酶，即使5'末端、3'末端存在错配，高保真DNA聚合酶可在退火后切割去除错配序列(<10nt)，组装正确性高，无需反复筛选、测序。

4、兼容性强--支持<100bp片段、>10kb片段、低起始量组装，可使用合成的单链寡核苷酸ss0ligo连接2条双链片段(如插入接头、gRNA文库)。

5、方便快速--只需15min、在同一管中即可完成无缝克隆。

6、设计工具--提供NEBuilder.neb.com 在线设计软件，可以方便、快捷地进行NEBuilder组装引物设计，以获得高效率、高正确性的无缝组装。

 

二、NEBridge Golden Gate 组装

用于无缝克隆的Golden Gate组装技术(金门组装技术)，在dSDNA片段两端通过PCR扩增添加IIS型限制性内切酶识别位点，经IIS内切酶酶切后，识别位点被移除，形成互补的4碱基突出末端，再使用T4 DNA连接酶进行连接，可将多个DNA片段插入载体中，实现两个片段

、或多个片段的克隆，且克隆后无额外碱基的插入。

NEBridpe Golden Gate组装试剂，对传统技术进行升级，成功实现≤52个片段的高效组装，提供包括成品Golden Gate 试剂盒、50种IIS型限制性内切酶、连接酶预混液(添加了连接增强剂)、经典T4 DNA 连接酶等产品，帮助研究者快速构建重组质粒。

 

 

以IIS型限制性内切酶BSaI-HFv2为例，进行Golden Gate 组装时，需要在dsDNA片段的两端加上其识别位点(GGTCTC)。酶切后，识别位点被移除，组装片段末端带有设计好的特定4碱基突出以指导组装。

 

1、高组装效率--支持≤52个片段的高效组装，具备非常高的组装效率和组装准确率，其中<30个片段的组装效果更佳。

 

 

对于包含12、24、35、52个片段的Golden Gate 组装反应，显示了含有正确组装的菌落百分比。误差线为至少3个重复的标准差。以下几篇文献对此进行了报道:

1. Pryor, J.M., et al. (2022) ACS Synth. Biol.e0525

2.Pryor, J.M.et al.(2020).PLoS One,e8592

3.Potapov,V et al.(2018).ACS Synth.Biol.,e0333

 

2、丰富IIS型内切酶--NEB提供业内更多的50种IIS型限制性内切酶，其中9种酶经过Golden Gate 组装验证，提供了更多酶切位点选择，

 

 

 

3、高兼容性--支持高GC含量、高重复序列、<100bp片段、>15kb片段的复杂组装。

4、高保真度--NEB经典T4连接酶，通过高保真末端连接，提高复杂多片段组装的正确性(20个片段组装正确率>90%);升级的NEBridge连接酶预混液，对缓冲液体系、操作步骤进行优化，搭配NEB IIS型内切酶使用，可进一步提高连接效率和保真度。

 

 

 

图.使用NEBridge连接酶预混液进行24个片段的Golden Gate 组装。使用NEBridge连接酶预混液时，每微克载体DNA产生2.2±0.2*10⁶个正确组装的菌落，保真度为94.3±1%，而使用NEB T4 DNA连接酶缓冲液时，每微克载体DNA产生8.3±2.1*10⁵个正确组装的菌落，保真度为69.8士10.7%。

5、使用灵活--提供Golden Gate组装试剂盒(Bsa1-HFv2、BsmBI-v2)、50种llS型限制性内切酶、NEBridge连接酶预混液、T4 DNA连接酶等丰富产品形式，供实验人员灵活使用。

6、操作简单--酶切和连接反应可在同一管中完成，简化实验步骤。

7、

设计工具--探供GoldenGate.neb.com在线设计软件，可以方便、快捷地进行Golden Gate 组装引物设计，通过预测、评估粘性末端链接偏好，实现复杂片段的高保真组装。

DNA组装选择

 

北京云肽生物科技