Western Blot 凝胶（Polyacrylamide Gel）制作指南： 方法、技巧与常见问题

一、什么是 Western Blot 凝胶（PAGE）？

Western blot 凝胶是通过丙烯酰胺单体与交联剂（通常为双丙烯酰胺，bis-acrylamide）聚合形成多孔结构。蛋白质在电场中按分子量迁移，实现高分辨率分离。

与琼脂糖凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶孔径更小、分辨率更高，适用于 SDS-PAGE 和 Native PAGE，并可使用梯度或特殊配方。

自制凝胶的优势在于可以灵活控制以下几个方面：

1. 凝胶浓度和孔径大小

2. 凝胶厚度和板型

3. 梯度或特殊凝胶配方

二、凝胶结构组成

Western blot 常用凝胶为“两层结构”：

分离胶（Resolving Gel）

· pH 8.8

· 丙烯酰胺浓度较高

· 负责按分子量分离蛋白

浓缩胶（Stacking Gel）

· pH 6.8

· 丙烯酰胺浓度较低（通常 4–5%）

· 作用是将样品压缩成窄条带，提高分辨率

浓缩胶的存在，是条带“又细又直”的关键。

三、常用凝胶制作方法

1. 标准垂直凝胶（SDS-PAGE）

这是蛋白分析最常用的方法。基本流程如下：

· 配制分离胶（Resolving Gel）和浓缩胶（Stacking Gel）

· 组装凝胶板和间隔片

· 倒入分离胶，待略微凝固后倒入浓缩胶

· 插入梳子形成样品孔

· 浓缩胶可以将蛋白浓缩成锐利条带，从而提高分辨率。

推荐仪器：Hoefer 垂直电泳装置

2. 梯度凝胶（Gradient Gel）

梯度凝胶丙烯酰胺浓度逐渐变化，可同时分离低分子量和高分子量蛋白。

优点：

1. 蛋白大小跨度大时分辨率更高

2. 避免多次跑不同浓度凝胶

注意事项：

· 需要梯度混合器或泵

· 流速和时间必须保持均匀

· 聚合需均匀，避免局部过快或过慢

应用：蛋白组学、复杂样品分析

推荐仪器：Hoefer 梯度混合器

3. 非变性 PAGE（Native PAGE）

非变性PAGE保留蛋白天然结构和活性，不使用 SDS 或还原剂。适用于研究蛋白复合物、酶活性或构象变化。

特点：

· 由丙烯酰胺（acrylamide）和交联剂（bis-acrylamide）聚合而成

· 不含 SDS 或还原剂

· 缓冲体系需保持蛋白天然结构和活性

· 聚合条件与 SDS-PAGE 类似，但操作更敏感

四、凝胶浓度选择

选择合适丙烯酰胺浓度是分离效率的关键。一般参考如下表：

蛋白分子量 (kDa)	推荐凝胶浓度 (%)
<10	15–20
10–30	12–15
30–70	8–12
>70	6–8

高浓度凝胶 → 小孔径 → 小蛋白分辨率高
低浓度凝胶 → 大孔径 → 大蛋白迁移顺畅

五、不同浓度分离胶与浓缩胶配方（以 10 mL 为例）

A: 分离胶 (10 ml)

组分	8%	10%	12%	15%
ddH₂O	4.63 ml	4.0 ml	3.3 ml	2.3 ml
30% Acr-Bis (29:1)	2.67 ml	3.3 ml	4.0 ml	5.0 ml
1.5M Tris-HCl (pH 8.8)	2.5 ml	2.5 ml	2.5 ml	2.5 ml
10% SDS	100 µl	100 µl	100 µl	100 µl
10% APS	100 µl	100 µl	100 µl	100 µl
TEMED	6 µl	4 µl	4 µl	3 µl

B: 浓缩胶 (5 ml)

组分	体积
ddH₂O	3 ml
30% Acr-Bis (29:1)	0.67 ml
1.0M Tris-HCl (pH 6.8)	1.25 ml
10% SDS	50 µl
10% APS	50 µl l
TEMED	5 µl

注意：APS 必须现配现用，TEMED 最后加入。