RT-PCR操作攻略

准备阶段：合成引物，购买优利科RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、RT-PCR试剂盒，购买耗材：八联冠，无酶加样枪头，无酶手套。
在进行RT-PCR之前，我们需要设计拟分析基因的引物，如何设计呢？首先我们需要找到该基因的编码序列CDS(Coding sequence)。
有了编码序列接下来可以设计引物了。

当引物设计好后，就可以开始正式实验了。注意除了目的基因的引物，还需要内参基因引物，例如β-Actin,GAPDH。

 

提取RNA：提取RNA,常用的如trizol法，吸附柱法。当然，这些都有相应的试剂盒，咨询优利科（上海）生命科学有限公司，按照说明进行操作就可以了。

 

RNA纯度检测:当用试剂盒提取到RNA后，需要对RNA的纯度进行检测，一般用微量分光光度计测定OD260/OD280的比值，介于1.9-2.0（或1.8-2.0）说明RNA纯度较高。

 

RNA完整性检测：通过RNA电泳，检测28S,18S,5S等小分子RNA条带，具体操作步骤根据购买的试剂盒说明书进行。

 

逆转录：这一步的目的是将RNA逆转录成cDNA,购买相应的反转录试剂盒，按照说明书进行操作即可。注意，该操作在八联管中进行，会用到qpcr仪（根据实验室qpcr仪操作说明完成操作）

qPCR:得到cDNA后，可以对其进行扩增并检测，SYBR染料法和探针法比较常用，根据需求选择相应的试剂盒。将相关试剂加入八联管(一般来说每个样本设置3个或4个复孔。记得要加入内参基因!)，放入qpcr仪中,设置好温控程序，该程序可以使用qpcr试剂盒说明书推荐的程序，也可以按照实验室以往设置好的程序。

 

等待一两个小时后，就可以导出我们所需的Ct值进行分析了。但现在很多qpcr的程序中只能导出Cq值，两者是可以互通的。
数据分析：假设我们得到下面一组数据（瞎编的数据，Well这部分编号出现了重复，之前没注意到，大家无需理会）

对数据进行分析：我们可以获得基因的绝对表达情况，需要作标准曲线，这也不难。但用得更多的是评估每个基因的相对表达。一般采用2-ΔΔCt计算，这里简单演示一下。

 

利用公式计算复孔平均值


ΔCq=每组内基因的Cq-内参基因的Cq



如法炮制，得到所有的ΔCq



ΔΔCq=实验组基因的ΔCq-对照组Control对应基因的ΔCq，如图所示


 

有了ΔΔCq，接下来就可以计算2-ΔΔCt

 

选择公式，输入power,点击转到



进入power函数设置窗口
 

Number输入底数，Power输入幂值-ΔΔCq

之前我们每组设置3个或4个复孔，属于技术性重复。还需要进行3次生物学重复试验，获得三次数据。有了三次数据，就可以进行统计分析了

 

统计分析：打开graphpad

输入三次实验的数据，这里没有实验数据，就随便填写了几个




输入数据后，点击Analyze,对实验数据进行统计学分析，选择适合自己实验的统计学方法



另外，点击Graphs可以绘制图片



至此，RT-PCR实验流程基本走完。