优利科(上海)生命科学有限公司
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技术资料/正文
细胞复苏、传代与冻存操作流程
82 人阅读发布时间:2023-02-28 14:42
仪器与试剂
仪器 |
试剂 |
耗材 |
离心机 |
胎牛血清(FBS) |
离心管(15ml、50ml) |
生物安全柜 |
无菌 1×PBS pH=7.2 |
T-25 细胞培养瓶 |
电动移液器 |
0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA |
一次性无菌移液管(2ml、5ml、10ml) |
CO2 培养箱 |
完全培养基(含血清) |
1.8mL 冻存管 |
倒置显微镜 |
冻存液:90%FBS+10%DMSO |
程序降温盒 |
恒温水浴锅 |
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超低温冰箱 |
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护目镜、厚毛线手套等
操作流程
复苏
1)将恒温水浴锅中的水预热到 37℃;
2)准备一支 15ml 离心管,加入 5ml 含 10%FBS 的完全培养基,放入 37℃水浴锅中预热;
3)戴上护目镜,厚毛线手套后,从液氮罐中取出要复苏的细胞,尽快转入 37℃恒温水浴锅中复温晃动冻存管以提高复温速率;
4)将融化了的冻存管中的细胞吸入事先准备的离心管中,混匀后,1000rpm 离心 5min;
5)准备一个 T-25 培养瓶,写上细胞名称、日期,再加入 4ml 完全培养基;
6)离心完成后弃去上清,用 1ml 完全培养基重悬细胞后,转入 T-25 细胞培养中,混匀后转入O2 培养箱中培养静置。
注意:从液氮中取出细胞冻存管时,若冻存管内有液氮进入,需拧松冻存管,排出内部残留的液氮,之后拧紧冻存管,置于干冰上,然后放入 37℃水浴中,避免温差太大造成液氮快速气化而爆炸。
传代
(细胞传代建议一传二)
1.当细胞汇合度达到 85%以上时,可进行传代。
2.在生物安全柜内,打开培养瓶瓶口,收集瓶内的培养基;
3.向培养瓶内加入 3ml 无菌的 1×PBS 后,水平放置培养瓶,使 PBS 能够浸润到培养瓶底面上所有的面积,吸弃 PBS;
4.向瓶内加入消化液 1ml,浸润底面后放入 37℃ CO2 培养箱中孵育 1~2min;
5.孵育完成后在倒置显微镜下观察细胞是否变圆飘起,若全部消化下来则直接向培养瓶内加入2ml 含 10%FBS 的完全培养基中,将悬液吸入 15ml 离心管;
注:如还有部分细胞未消化下来,可采用分步消化:
① 准备一个无菌的 15ml 离心管,加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基;
② 将消化下来的细胞吸入①中的离心管内中和(避免吹打);
③ 向之前消化的培养瓶中加入 1ml 胰酶继续消化 2min 左右,轻拍培养瓶,95%左右细胞脱落后加入 2ml 含 10%FBS 的完全培养基中和,中和后的细胞悬液移入①中的离心管内。
6.1000rpm 离心 5min;
7.准备两个新的 T-25 培养瓶,各加入 4ml 完全培养基。
8.离心完成后,弃上清,用 2ml 完全培养基重悬离心细胞,将重悬后的细胞转入 2 个 T-25 培养瓶,每个培养瓶各 1ml;
9.水平放置培养瓶,震荡混匀后,将培养瓶置于 37℃,5%CO2 培养箱中静置培养。
冻存
(细胞冻存建议每瓶 T25 冻一支)
1~6)参照传代步骤
7)离心完成后,弃上清,用 1mL 冻存液重悬细胞沉淀,然后转入 1.8ml 冻存管中;
8)将冻存管转入填充满异丙醇的程序降温盒中,之后转入-80℃冰箱中过夜降温;
9)第二天,取出降温完成的序降温盒中的冻存管,尽快转入液氮罐中保存。