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ELISA（酶联免疫技术概述）
869 人阅读发布时间：2022-03-16 17:44
ELISA（酶联免疫技术概述）
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA或ELASA）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。酶联免疫吸附测定（ELISA）为免疫学中的经典实验，本词条从定义、基本原理、分类方法、操作要点等方面对其进行了详细介绍。一：ELISA技术基本原理
ELISA技术的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
二：分类方法
常用的ELISA可以分为以下五大类：①直接ELISA；②间接ELISA；③夹心ELISA；④竞争ELISA；⑤竞争抑制ELISA。其他的ELISA都隶属于这五类ELISA或由这五类ELISA组合衍生。
1．直接ELISA
其方法是将抗原按一定的比例稀释好包被到固相载体上，然后加入稀释好的特异性的酶标抗体，孵育后加入底物显色并判读结果。直接ELISA操作很简单，步骤也比较简练，但是其应用范围还是非常有限的，一个重要的原因是这种ELISA中只经过了一步信号放大（酶的放大），所以其灵敏度不是很高；另外，其测定的对象也非常有限，只能测定酶标记的分子。
2．间接ELISA
间接ELISA与直接ELISA不同的是，间接ELISA中与包被好的抗原结合的是非酶标抗体，另外再引入第二种抗体（即二抗）。二抗是经过酶标的，它可以与第一种抗体特异性结合，最后加入底物显色并判读结果。由于二抗一般为多抗，因此，一个一抗分子上可以结合多个二抗分子，同时，一个二抗分子上可以标记上多个酶分子，所以当待测抗体为多抗时，信号经过两步放大，最终提高了检测的灵敏度。另外，由于二抗制备比较容易，而且很早就开始商品化，所以操作者无需要将一抗进行酶标，大大缩减了工作量。在检测抗体的效价、血清的效价以及单克隆抗体的筛选过程中，间接ELISA都是非常重要的实验过程，在临床诊断中，间接ELISA也是检测标志性抗体的重要手段。
3．夹心ELISA
夹心ELISA总体上可以分为两种，直接夹心ELISA和间接夹心ELISA。
直接夹心ELISA又分为双抗体夹心ELISA和双抗原夹心ELISA。
双抗体夹心ELISA的方法是将第一种抗体（捕获抗体）包被在固相载体上，封闭后加入待检抗原，温育后加入第二种抗体（检测抗体），捕获抗体和检测抗体可以是针对不同表位的两种单抗，也可以是针对同一抗原的一种单抗与一种多抗，但是检测抗体需要经过酶标。
双抗原夹心ELISA的原理和操作与双抗体夹心ELISA基本相同，不同的是包被的是抗原，待检对象是抗体，然后加入酶标抗原，再加底物显色。
对于双抗体夹心ELISA，待检对象必须包括两个或者两个以上的表位，否则检测抗体无法与待检抗原结合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用双抗体夹心ELISA检测的。对于双抗原夹心ELISA，其操作与间接ELISA基本相同，但利用特异性的抗原代替酶标二抗，所以特异性比间接法更好。另外，由于间接ELISA中使用的二抗一般只能识别IgG，而双抗原夹心ELISA中任何类似的免疫球蛋白都可以被检测出，因此，双抗原夹心ELISA比间接ELISA也更灵敏。
间接夹心ELISA是基于两种不同种属来源的抗体的夹心ELISA，其原理是将一种种属来源的特异性抗体包被于固相载体上（作为捕获抗体），封闭，加入待检抗原，温育，洗涤后加入另一种种属来源的特异性抗体（非酶标，作为检测抗体），最后加入酶标二抗（特异性识别检测抗体），再加底物显色。与直接双抗夹心ELISA相比，间接夹心ELISA中引入了特异性识别检测抗体的酶标二抗，相当于整个体系的信号增加了一步放大系统，于是最终的结果比直接双抗夹心ELISA更灵敏。同时，由于间接夹心ELISA中的酶标二抗仅能识别检测抗体，而不能识别捕获抗体，所以体系的特异性也得到了保障。
4．竞争ELISA
本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液；而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。
5．竞争抑制ELISA
预先将抗原包被在固相载体上，实验时加入稀释好的待检抗原（或抗体），然后依次加入特异性的抗体以及此抗体对应的酶标二抗。待检标本中的抗原（或抗体）就和预制备体系中固相载体上结合的抗原（或抗体）竞争结合特异性的抗体（或固相载体上结合的抗原）。洗掉被竞争的特异性抗体，最后加底物显色。最终显色的结果与待检抗原（或抗体）量呈反比。
三：ELISA试剂盒基本组成
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：
（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；
（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
（3）酶的底物；
（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；
（5）结合物及样本的稀释液；
（6）洗涤液；
（7）酶反应终止液。
四：ELISA技术基本配套仪器
1、微孔板酶标仪450nm/630nm
2、旋转蒸发仪/氮气吹干装置
3、均质器
4、振荡器
5、涡旋仪
6、离心机
7、天平：感量0.01g
8、微量移液器：单道 20ml～200ml、100ml～1000ml
多道 250ml
9、超声仪
10、恒温培养箱/生化培养箱
11、冰箱
12、洗板机（可选）
13、磁力搅拌器
五：ELISA技术优缺点
1）优点
1、检测灵敏度高，可达到ug/kg或ng/kg水平。
2、特异性强。
3、对仪器设备要求不高，测定成本低。
4、方法快速、简便。
5、试剂保存时间较长。
6、自动化程度高。
7、方法种类多。
8、无放射性同位素污染。
2）缺点（潜在危害）
1、在酶标记物的制备和（半）抗原—蛋白质欧联过程中，一些化学物质的毒性很强；但在试剂盒建立成功后，毒性物质已被处理，因此在成品试剂盒使用过程中无雌类毒害问题。
2、在酶免疫测定过程中，酶的底物和生色源或供氢体可能产生毒害效应。
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