光控导航者：pQE32-pr-mEosFP (V69T) 的克隆、表达与精准纯化

一、载体与蛋白简介

         pQE32-pr-mEosFP (mEosFP-V69T) 是一种在原核系统中高效表达光转换荧光蛋白的重组质粒载体。该载体基于 pQE-32 骨架构建，携带 T5 启动子和 6×His 标签，支持 IPTG 诱导表达与镍柱亲和纯化。其核心元件 mEosFP-V69T 是 mEosFP 的优化突变体，通过第69位缬氨酸（Val）突变为苏氨酸（Thr），显著提升蛋白的光稳定性和成熟效率，使其成为超高分辨率显微成像（如PALM/STORM）的理想探针。

二、蛋白特性与优势

• 光转换特性：在 405 nm 激光激发下，荧光发射峰从绿色（516 nm）不可逆转换为红色（581 nm），实现单分子定位追踪。

• 突变优势：V69T 突变减少聚集倾向，提升可溶性和光激活效率，降低背景噪音。

• 标签系统：C端 6×His 标签简化纯化流程，适用于体外标记与蛋白质相互作用研究。

三、分离提取实验流程

以下为 mEosFP-V69T 在大肠杆菌中的表达与纯化方案：

1. 表达阶段

• 宿主菌：选用 E. coli M15 (pREP4) 或 BL21(DE3) 等适配 pQE 载体的菌株。

• 诱导条件：

  • 37℃培养至 OD₆₀₀ ≈ 0.6，加入 0.5–1 mM IPTG。

  • 关键优化：25℃诱导 16–20 小时，提升可溶性表达比例。

2. 细胞裂解与粗提

• 离心收集菌体，用 Lysis Buffer (20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM 咪唑, pH 8.0) 重悬。

• 超声破碎（冰上操作，功率 200 W，工作 3s/停 5s，总时长 15 min）。

• 离心（12,000 ×g, 30 min, 4℃）取上清，保留可溶性组分。

3. 亲和层析纯化

• 填料：Ni-NTA 树脂

• 步骤：

  • 上清液过柱，流速 ≤ 1 mL/min。

  • 洗涤：用含 30 mM 咪唑 的 Lysis Buffer 去除非特异性结合。

  • 洗脱：梯度增加咪唑浓度（50–300 mM），目标蛋白通常在 250 mM 咪唑时被洗脱。

4. 脱盐与储存

• 使用 PD-10 脱盐柱置换缓冲液至 Storage Buffer (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7.4)。

• 分装后于 –80℃ 避光保存，避免反复冻融。

四、质量控制要点

• 纯度验证：SDS-PAGE 检测应显示单一 ~28 kDa 条带（纯度 >95%）。

• 功能检测：

  • 荧光光谱扫描确认双峰特征（绿/红荧光）。

  • 405 nm 激光照射验证光转换效率。

五、应用场景

• 单分子超分辨显微成像（PALM）

• 活细胞动态追踪与蛋白质共定位分析

• 生物传感器构建与分子互作研究

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结语

pQE32-pr-mEosFP (mEosFP-V69T) 凭借其优异的光物理特性与便捷的纯化策略，为前沿成像研究提供了强大工具。智立中特（武汉）生物科技有限公司持续优化重组蛋白制备工艺，致力于为科研与诊断领域提供高纯度、高活性的荧光探针解决方案。

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