SKNO-1 人急性髓系白血病细胞：研究利器与复苏指南

        SKNO-1 细胞是一种重要的人急性髓系白血病 (AML) 细胞系，由日本学者于 1991 年从一名 AML-M2 亚型患者的外周血单核细胞中建立。该细胞系因其独特的生物学特性，已成为 AML 发病机制、分化诱导治疗（尤其是全反式维甲酸 ATRA 和粒细胞集落刺激因子 G-CSF/GM-CSF 的研究）、化疗药物筛选及耐药机制探索等领域不可或缺的体外模型。

• 核心特性：

  • GM-CSF 依赖性： SKNO-1 细胞的存活和增殖高度依赖于外源性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)。撤除 GM-CSF 会诱导细胞凋亡。

  • 分化潜能： 在 ATRA 或 G-CSF/GM-CSF 等因子作用下，SKNO-1 细胞可被诱导向粒细胞方向分化，模拟 AML 细胞的分化阻滞解除过程，是研究分化疗法的经典模型。

  • 形态特征： 悬浮生长，细胞呈圆形或略不规则形。

  • 遗传特征： 携带 t(8;21)(q22;q22) 染色体易位，导致 *RUNX1-RUNX1T1* (AML1-ETO) 融合基因的表达，这是 AML-M2 中常见的分子标志。该融合基因在白血病的发生和维持中起关键作用。

• 研究价值： SKNO-1 细胞为理解 AML（特别是 M2 亚型）的分子基础、探索新的靶向治疗策略（如针对 AML1-ETO 或分化通路的药物）、评估药物疗效及耐药性提供了宝贵的平台。

一、SKNO-1 细胞复苏关键步骤

成功的复苏是开展后续研究的基础。遵循无菌操作规范至关重要。本指南基于标准程序，建议使用含 10% FBS 和 10 ng/mL 重组人 GM-CSF 的 RPMI-1640 培养基（或其他已验证适用的培养基）。

材料准备：

• 37°C 水浴锅

• 离心机

• 完全培养基 (RPMI-1640 + 10% FBS + 10 ng/mL GM-CSF + 1% Pen/Strep)

• 15mL 无菌离心管

• 75 cm² 细胞培养瓶或适当规格的培养皿/孔板

• 移液器及无菌吸头

• 70% 乙醇

• 冻存管（含 SKNO-1 细胞，通常储存在液氮或 -150°C 以下超低温冰箱）

• 个人防护装备 (实验服、手套、护目镜)

复苏操作流程：

1. 预热： 将完全培养基置于 37°C 水浴或培养箱中预热至少 30 分钟。

2. 安全防护： 佩戴好手套和护目镜。从液氮罐中取出冻存管时务必小心，防止冻存管因密封不严或温度骤变发生爆裂。建议佩戴面罩或使用液氮罐防护手套。

3. 快速解冻： 将冻存管立即放入 37°C 水浴中，轻轻摇动，确保在 1-2 分钟内 完全融化（至管内仅剩极少量小冰晶时即可取出）。此步骤需迅速，减少 DMSO 对细胞的毒性作用。

4. 消毒与转移： 用 70% 乙醇彻底擦拭冻存管外壁消毒。在生物安全柜内打开管盖。用无菌吸头将细胞悬液缓慢转移到含有 5-9 mL 预热的完全培养基 的 15mL 离心管中。此稀释步骤可进一步降低 DMSO 浓度。

5. 离心清洗： 盖上离心管盖，在室温下以 200-250 x g 离心 5 分钟。离心目的是去除含有冷冻保护剂 DMSO 的上清液。

6. 去上清与重悬： 小心吸弃上清液，避免扰动底部的细胞沉淀。用 1-2 mL 新鲜的、预热的完全培养基 轻柔地重悬细胞沉淀。吹打时动作要轻缓，避免产生过多气泡损伤细胞。

7. 细胞计数与评估 (可选但推荐)： 取少量细胞悬液进行台盼蓝染色，用细胞计数板或自动细胞计数仪计数，计算细胞存活率。健康的复苏细胞存活率应 >80%。

8. 接种培养： 根据计数结果和目标密度，将细胞悬液转移至含有适量新鲜预热的完全培养基的培养容器（如 T-75 培养瓶，推荐初始接种密度为 3-5 x 10⁵ cells/mL，总体积 10-15mL）中。若未计数，通常将重悬的 1-2mL 细胞悬液直接加入装有 10-15mL 新鲜培养基的 T-75 培养瓶中。

9. 培养启动： 轻轻晃动培养瓶使细胞分布均匀。将培养瓶放入 37°C, 5% CO₂, 高湿度 的培养箱中。

10. 次日观察与换液： 复苏后 16-24 小时，在显微镜下观察细胞状态（形态、是否贴壁、碎片多少）。此时可进行首次 半量换液：小心吸弃约一半体积的旧培养基（可能含有较多死细胞和碎片），加入等体积预热的新鲜完全培养基。这有助于进一步清除残留的 DMSO 和细胞碎片，提供新鲜营养。

11. 后续培养： 根据细胞生长速度和密度，每 2-3 天进行一次半量换液或传代（当细胞密度接近 1-2 x 10⁶ cells/mL 时）。始终保持培养基中含有 10 ng/mL GM-CSF。

二、复苏成功要点与注意事项

• 速度是关键： 解冻和稀释步骤要迅速，最大限度减少 DMSO 暴露时间。

• 轻柔操作： 离心后重悬和吹打细胞时务必轻柔，避免机械损伤。

• GM-CSF 不可或缺： 培养基中必须添加足量且活性良好的重组人 GM-CSF (10 ng/mL)，否则细胞无法存活增殖。

• 无菌至上： 所有操作务必在生物安全柜内严格按照无菌规范进行，严防污染。

• 定期观察： 复苏后及后续培养中要勤于在显微镜下观察细胞形态、密度和健康状况。

• 冻存质量： 复苏成功率很大程度上依赖于冻存时细胞的状态（高活力、高密度）和冻存操作是否规范。使用优质冻存液（如含 10% DMSO 的完全培养基）并遵循标准程序冻存至关重要。

• 污染处理： 一旦发现污染（浑浊、pH 异常、镜下可见微生物），立即废弃该培养物，彻底消毒相关区域和用具。

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