智立中特pCMV-HA-UB质粒提取方法介绍

         在探索生命奥秘的征途上，泛素化（Ubiquitination）作为一种关键的蛋白质翻译后修饰，如同细胞内的精密“开关”，调控着蛋白质的稳定性、定位、活性和相互作用，深刻影响着细胞周期、信号传导、DNA修复、免疫应答乃至疾病发生（如癌症、神经退行性疾病）等几乎所有核心生命过程。要深入解析泛素化的复杂机制及其生物学功能，拥有一款高效、可靠的研究工具至关重要。

智立中特生物技术有限公司隆重推出：pCMV-HA-UB 质粒

pCMV-HA-UB 质粒正是这样一款为泛素化研究量身打造的核心载体。它整合了多项优势，旨在助力科研人员高效、便捷地开展相关实验：

1. 强大的驱动引擎 - CMV 启动子： 质粒搭载了来自巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）的强效立即早期启动子。该启动子在绝大多数哺乳动物细胞系中均能驱动目的基因进行高水平、组成型表达，确保您研究的泛素蛋白（Ubiquitin, UB）在细胞内充分表达，满足各种功能研究的需求。

2. 灵敏的追踪标签 - HA 表位标签： 在泛素蛋白（UB）的N端或C端（具体位置请参考公司产品说明书）融合了血凝素（Hemagglutinin, HA） 表位标签。这个小型、高度特异性的标签为研究人员提供了极大的便利：

   • 高效检测： 可使用商品化、高亲和力的抗HA抗体，轻松通过Western Blot、免疫沉淀（IP）、免疫荧光（IF）等技术检测泛素蛋白的表达水平和细胞内定位。

   • 便捷纯化： 利用抗HA抗体或HA标签结合树脂，可以高效地从细胞裂解液中免疫沉淀（IP）或亲和纯化 HA-UB融合蛋白及其相互作用的蛋白复合物（如被泛素化的底物蛋白），是研究泛素化修饰网络的利器。

3. 核心研究对象 - 泛素蛋白（UB）： 质粒携带编码人源或常用物种（请确认产品具体种属来源）泛素蛋白的基因序列。泛素作为修饰“标签”本身，其表达是研究泛素化通路的基础。

4. 广泛的应用场景：

   • 过表达研究： 在细胞中过表达泛素，研究其对特定信号通路、蛋白稳定性（如与蛋白酶体抑制剂联用）、细胞表型（增殖、凋亡、自噬等）的影响。

   • 泛素化底物鉴定： 通过HA标签进行免疫沉淀，结合质谱分析（IP-MS），大规模筛选和鉴定细胞内被泛素修饰的底物蛋白。

   • 泛素链类型研究： （需注意：基础UB通常是单泛素或可能形成多聚泛素链，特定链型研究可能需要突变体）为研究不同连接方式（K48, K63等）的多聚泛素链功能奠定基础。

   • 报告系统构建： 可作为构建泛素化报告系统或融合蛋白的基础载体。

如何从智立中特获取高质量的 pCMV-HA-UB 质粒？—— 高效的提取流程

智立中特生物技术有限公司提供的 pCMV-HA-UB 质粒通常以高纯度的质粒DNA（溶于无菌TE缓冲液或水）或转化在高效感受态细胞（如DH5α）中的甘油菌形式交付。收到产品后，若您需要扩增和提取质粒，请遵循以下标准且高效的方案：

实验前准备：

• 试剂盒： 推荐使用高质量的质粒小提试剂盒（如基于硅胶膜离心柱的试剂盒，例如Qiagen, Thermo Fisher, Omega Bio-tek, 天根生化等品牌）。这些试剂盒操作简便、快速（通常30-60分钟）、纯度高，能有效去除内毒素（对转染实验尤为重要）。

• 仪器： 微型离心机、涡旋振荡器、恒温摇床、无菌操作台。

• 耗材： 无菌的1.5 mL 离心管、枪头、LB液体培养基（含适当抗生素，通常为Ampicillin，100 µg/mL）、LB固体琼脂平板（含相同抗生素）。

提取步骤概要：

1. 复苏与扩增：

   • 若收到甘油菌：取少量甘油菌划线于含Amp的LB琼脂平板上，37°C倒置培养过夜（12-16小时）。

   • 挑取单菌落接种于3-5 mL含Amp的LB液体培养基中。

   • 37°C, 200-250 rpm剧烈振荡培养过夜（约12-16小时）。

2. 收集菌体：

   • 取1.5-5 mL过夜培养的菌液（菌量是得率关键）加入1.5 mL离心管中。

   • 最高速（≥12,000-13,000 rpm）离心1分钟，弃尽上清。确保菌体沉淀尽可能干燥。

3. 菌体重悬：

   • 加入试剂盒提供的Resuspension Buffer (Buffer P1)。彻底涡旋振荡或吹打重悬菌体沉淀，确保无可见菌块。这是裂解成功的基础。

4. 细胞裂解：

   • 加入试剂盒提供的Lysis Buffer (Buffer P2)。立即温和但充分地颠倒离心管5-10次（切勿涡旋！），使溶液变得粘稠、清亮。此步骤不宜超过5分钟。

5. 中和：

   • 加入试剂盒提供的Neutralization Buffer (Buffer P3/N3)。立即温和但充分地颠倒离心管5-10次（可稍用力），直至形成均匀的絮状沉淀，溶液不再粘稠。最高速离心5-10分钟，使沉淀物（基因组DNA、蛋白质、SDS复合物等）紧密成团。

6. 结合质粒DNA：

   • 小心将上清液（含质粒DNA）转移至试剂盒提供的吸附柱（Spin Column） 中（柱已置于收集管中）。

   • 最高速离心30-60秒。弃掉滤液和收集管。

7. 洗涤：

   • 将吸附柱放回新的收集管中。加入试剂盒提供的Wash Buffer (Buffer W1)（通常含乙醇）。

   • 最高速离心30-60秒。弃掉滤液和收集管。

   • 可选但推荐（尤其对转染实验）：重复加入Wash Buffer (Buffer W2)（通常含高浓度乙醇）洗涤一次，最高速离心30-60秒。确保弃尽废液。此步骤可进一步去除盐分和杂质。

   • 将空吸附柱最高速离心1-2分钟，彻底去除残留乙醇。乙醇残留会影响后续实验。

8. 洗脱：

   • 将吸附柱置于一个新的无菌1.5 mL离心管上。

   • 向吸附柱膜中央加入30-50 µL预热的（65-70°C效果更佳）Elution Buffer (Buffer EB) 或无菌ddH₂O/TE缓冲液。室温静置1-2分钟。

   • 最高速离心1分钟洗脱质粒DNA。洗脱体积越小，浓度越高。

9. 质检与保存：

   • 浓度与纯度检测： 使用微量分光光度计（Nanodrop）检测质粒DNA浓度（ng/µL）和纯度（A260/A280比值应在1.8-2.0，A260/A230 > 2.0）。

   • 完整性验证： 进行琼脂糖凝胶电泳（0.8%-1%琼脂糖凝胶），观察质粒应主要为超螺旋构型，条带单一、清晰，大小符合预期（pCMV-HA-UB通常~5-6 kb，具体请查说明书）。

   • 保存： 短期存放于4°C，长期保存于-20°C或-80°C。避免反复冻融。

智立中特提示：关键注意事项

• 无菌操作： 全程在无菌操作台或使用无菌技术进行，避免污染。

• Buffer P2 使用： 含强碱SDS，操作需温和、快速，避免长时间作用导致基因组DNA断裂污染质粒。

• Buffer W 使用： Wash Buffer含乙醇，务必彻底去除，否则影响下游酶活（如酶切、测序、转染效率）。

• 内毒素控制： 如果质粒用于敏感细胞（如原代细胞、干细胞）转染，建议选择标有“Endotoxin-Free”或“Transfection-Grade”的试剂盒，或使用专门的去内毒素试剂/柱进行额外处理。智立中特也可提供低内毒素级别的质粒制备服务。

• 菌液量： 根据试剂盒推荐的上样量使用菌液，过多会降低裂解效率和纯度。

• 测序验证： 对于关键实验，强烈建议对提取的质粒进行测序，验证插入片段（HA-UB）的正确性和序列完整性。

选择智立中特，选择卓越研究伙伴

智立中特生物技术有限公司致力于为生命科学研究提供高品质、可靠的工具和服务。我们严格把控pCMV-HA-UB等质粒的构建、生产和质检流程，确保您获得性能卓越的研究载体。结合上述高效的质粒提取方法，您将能快速获取高质量的pCMV-HA-UB质粒DNA，加速您在泛素化调控这一重要生命现象研究领域的探索步伐。