智立中特pCMV-RAI14-FLAG-Neo同义突变质粒的智能提取与应用

一、质粒载体设计核心解析

     pCMV-RAI14(human)-FLAG-SV40-Neo(2同义突变) 是一款高度工程化的哺乳动物表达载体，其结构设计兼顾高效表达、精准标记与遗传稳定性：

1. pCMV启动子：人巨细胞病毒强启动子，驱动RAI14基因在哺乳细胞中持续高表达；

2. RAI14(human)：人源视黄酸诱导蛋白14（Retinoic Acid Induced 14），参与细胞迁移、粘附与信号转导，与肿瘤转移及发育调控密切相关；

3. FLAG标签：C端融合FLAG表位标签（DYKDDDDK），支持免疫沉淀（IP）、免疫荧光（IF）及Western Blot高效检测；

4. SV40-Neo抗性：新霉素抗性基因，由SV40启动子驱动，用于稳定细胞株筛选；

5. 2同义突变设计：在Neo基因关键区域引入同义突变，规避专利限制同时保持G418抗性功能不变。

二、质粒提取标准化流程（智立中特SOP）

步骤1：菌株活化与高拷贝培养

• 宿主菌：DH5α或TOP10等高转化效率大肠杆菌；

• 培养基：LB + 50μg/mL Kanamycin，37℃震荡培养16小时（OD₆₀₀≈4.0）。

步骤2：质粒大规模提取（碱裂解法优化版）

1. 菌体收集：4,000g离心10分钟，收获湿重≥0.3g/100mL培养液；  
2. 裂解处理：P1/P2/P3三步法（含RNase A），精确控制裂解时间≤5分钟；  
3. 柱纯化：采用硅胶膜吸附柱（Endotoxin-Free规格），经AW/WB缓冲液去杂质；  
4. 洗脱：超纯水（pH 8.5）洗脱，浓度可达1.0–1.5μg/μL。  

步骤3：质控四重验证

三、技术创新点与核心价值

1. 同义突变智能设计

   • 规避商业质粒专利限制，保障用户研究合规性；

   • 突变位点经密码子优化，不影响翻译效率及抗性强度。

2. FLAG标签融合优势

   • 支持一步法纯化RAI14蛋白复合物（如Anti-FLAG M2磁珠）；

   • 适用于蛋白质互作组学（Co-IP-MS）研究。

3. 双启动子协同表达

   • CMV驱动目的基因，SV40驱动抗性基因，避免表达干扰；

   • 显著提升稳转细胞株筛选成功率（>80%）。

四、应用场景与案例方向

• 肿瘤转移机制研究：RAI14在乳腺癌、前列腺癌中高表达，调控EMT过程；

• 基因功能缺失/增益实验：结合CRISPR敲除，验证RAI14在细胞迁移中的功能；

• 药物靶点筛选平台：构建稳转株进行抗转移化合物高通量筛选；

• 蛋白互作网络解析：通过FLAG标签捕获RAI14相互作用蛋白组。

五、智立中特技术服务保障

• 超低内毒素级别：≤0.1 EU/μg（适用于体内转染实验）；

• 批次一致性控制：NGS全长质粒测序确保序列准确性；

• 定制化解决方案：支持启动子替换、标签优化、突变体构建等需求。

　　智立中特（武汉）生物科技有限公司主要致力于质粒微生物资源的保护、共享和持续利用，围绕我国生命科学研究、生物技术创新和产业发展等重大需求，探索、发现、收集国内外的微生物资源，妥善长期保存管理；在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供质粒载体物物种资源、基因资源、信息资源和专业技术服务。旗下质粒载体网zlzt.com是一款提供质粒载体展示及定制的专业型网站，由智立中特（武汉）生物科技有限公司联合多家企业公司科研院校共同打造！主要展示了各种基因类型下的质粒载体！

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