NCI-N87+luc细胞培养全流程解析

       NCI-N87+luc 是在经典人胃癌细胞系 NCI-N87 基础上，通过基因工程稳定整合 荧光素酶 (luciferase, luc) 基因构建而成。该细胞保留了亲本细胞的肿瘤生物学特性，同时赋予其独特的生物发光成像能力，是胃癌机制研究、药物筛选及活体动物模型（如小鼠）中肿瘤生长/转移实时监测的理想工具。

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一、关键实验操作流程

1. 细胞复苏

• 材料准备： 37℃恒温水浴锅、完全培养基（RPMI-1640 + 10% FBS）、15mL离心管、培养瓶、移液器、70%乙醇。

• 操作步骤：

  1. 从液氮罐或-150℃超低温冰箱中迅速取出冻存管。

  2. 立即置于37℃水浴中，轻柔摇晃，1-2分钟内融化（切忌长时间水浴）。

  3. 用70%乙醇擦拭冻存管外壁消毒。

  4. 将细胞悬液转移至含5-7mL预温完全培养基的15mL离心管中。

  5. 离心： 300 x g，5分钟。

  6. 弃上清： 小心吸弃，避免触碰细胞沉淀。

  7. 重悬： 用适量（如2mL）新鲜完全培养基轻柔吹打沉淀，制成单细胞悬液。

  8. 接种： 将悬液转移至培养瓶（如T25），补充适量培养基（如5-8mL）。

  9. 培养： 放入37℃、5% CO₂、饱和湿度培养箱。

  10. 次日换液： 复苏后24小时，更换新鲜培养基以去除残留DMSO和死细胞。

2. 常规培养

• 培养基： RPMI-1640 + 10% 优质胎牛血清（FBS） + 1% 青霉素-链霉素双抗。

• 培养条件： 37℃, 5% CO₂, 饱和湿度。

• 换液频率： 每2-3天更换一次新鲜完全培养基。

• 生长特性： 贴壁生长，呈上皮细胞样，铺展良好。密度过高时可能堆积生长。

3. 细胞消化传代

• 材料准备： 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、PBS缓冲液、完全培养基、离心管、移液器、培养瓶。

• 操作步骤：

  1. 吸弃旧培养基。

  2. PBS洗涤： 加入适量PBS轻柔润洗细胞表面1-2次，吸弃，去除血清残留（血清抑制胰酶活性）。

  3. 加消化液： 加入适量胰酶-EDTA（如T25瓶加1mL），确保覆盖细胞层。

  4. 孵育： 37℃培养箱内孵育 2-4分钟（具体时间需显微镜观察，细胞变圆、间隙增大即可）。

  5. 终止消化： 加入 2倍于消化液体积 的完全培养基（含FBS），轻柔吹打瓶壁数次。

  6. 收集细胞： 将细胞悬液转移至离心管。

  7. 离心： 300 x g，5分钟。

  8. 弃上清、重悬： 弃上清，用新鲜完全培养基重悬细胞沉淀。

  9. 计数与接种： 细胞计数后，按合适比例（通常1：3至1：6）接种至新培养瓶，补充足量培养基。

  10. 培养： 放回培养箱。

4. 细胞冻存

• 材料准备： 对数生长期健康细胞、0.25%胰酶-EDTA、完全培养基、冻存液（90% FBS + 10% DMSO或商品化无血清冻存液）、细胞冻存管、程序降温盒（或可控降温仪）。

• 操作步骤：

  1. 消化收集： 按消化传代步骤1-7操作，获得细胞沉淀。

  2. 配制悬液： 用预冷的冻存液（4℃）重悬细胞沉淀，调整细胞密度至 5×10⁶ ~ 1×10⁷ cells/mL。

  3. 分装： 迅速将细胞悬液分装至标记好的冻存管（通常1.0-1.5mL/管）。

  4. 程序降温：

     • 推荐方法： 将冻存管放入程序降温盒（异丙醇盒），立即置于-80℃冰箱过夜（约24小时），使细胞以约-1℃/分钟的速度降温。

     • 次选方法（无降温盒）： 将冻存管置于泡沫盒或厚纸盒中，放入-80℃冰箱过夜。

  5. 长期保存： 次日，将冻存管迅速转移至液氮气相（或-150℃以下超低温冰箱）中长期保存。

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二、细胞保藏

• 短期保藏： 常规培养于培养箱，每2-3天传代或换液，保持细胞活性与状态。

• 长期保藏： 必须冻存于液氮气相（-196℃附近）或-150℃以下超低温冰箱。定期检查液氮罐液位和冰箱温度，确保稳定。

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三、复苏关键注意事项

1. 快速融化： 从超低温取出后务必立即、快速融化（37℃水浴），减少冰晶损伤。

2. DMSO去除： 融化后需尽快离心并用培养基洗涤稀释，去除残留DMSO（对细胞有毒性）。

3. 轻柔操作： 复苏、离心、重悬、接种过程动作需轻柔，避免机械损伤。

4. 及时换液： 复苏后24小时换液至关重要，清除死细胞碎片及残留冻存液。

5. 状态观察： 复苏后密切观察细胞贴壁、伸展和生长情况，评估复苏效果。

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四、核心应用领域

1. 胃癌发生发展机制研究： 研究基因功能、信号通路、细胞增殖/凋亡/侵袭转移等。

2. 抗肿瘤药物筛选与评价：

   • 体外： 检测药物对细胞增殖、活力、凋亡、迁移侵袭的影响。

   • 体内： 移植瘤模型（皮下、原位、转移瘤）中，利用生物发光成像（BLI）无创、实时、定量监测肿瘤生长、转移和对药物的反应，显著提高药效评估效率和准确性。

3. 肿瘤转移模型构建： 建立肝转移、腹膜转移等模型，研究转移机制及干预策略。

4. 新型治疗方法评估： 评价靶向治疗、免疫治疗（CAR-T, 抗体等）、基因治疗、纳米药物载体等在胃癌模型中的疗效。

5. 活体成像技术平台验证： 作为阳性细胞模型，用于生物发光成像设备、探针及成像方法的验证与优化。

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       智立中特(武汉)生物科技有限公司 致力于为生命科学研究提供高质量的细胞模型和技术支持。我们提供的NCI-N87+luc细胞株，经过严格的质量控制和功能验证（包括荧光素酶活性检测），确保其稳定的生物学特性和卓越的活体成像性能，是您深入探索胃癌奥秘、加速药物研发进程的可靠伙伴。