高效提取pET28a-BCL-2蛋白，解锁生命调控密钥

智立中特（武汉）生物科技有限公司，作为专注于生物技术研发与应用的前沿企业，深刻理解BCL-2蛋白研究的巨大价值。为了助力广大科研工作者高效获取这一关键蛋白，我们提供成熟可靠的pET28a-BCL-2表达系统及蛋白提取解决方案。

一、 pET28a-BCL-2：高效表达的强力引擎

pET28a-BCL-2是我们构建的重组蛋白表达载体，其核心优势在于：

1. 强大的pET系统： 基于广泛使用且高度优化的pET表达系统，受控于T7强启动子，可在合适的宿主菌（如BL21(DE3)）中实现高效、可诱导的蛋白表达。通过添加IPTG，研究人员可以精确控制BCL-2蛋白的表达时机和水平。

2. N端His-Tag融合： pET28a载体在克隆位点上游引入了6xHis标签序列。这意味着表达出的BCL-2蛋白在其N端融合了一个由6个组氨酸组成的短肽。这个标签是后续蛋白纯化的“黄金抓手”。

3. T7 Tag 和 Thrombin 位点 (可选)： 除了His标签，pET28a通常还包含T7 Tag（用于检测/亲和纯化）和凝血酶（Thrombin）切割位点（位于His标签和目的蛋白之间，便于在纯化后去除标签，获得天然BCL-2蛋白，根据具体构建而定）。

4. 卡那霉素抗性： 载体带有卡那霉素抗性基因，便于在培养过程中筛选和维持含有该质粒的细菌。

5. 成熟的克隆技术： 我们利用成熟的分子克隆技术，将人或其他物种的BCL-2基因准确克隆至pET28a的多克隆位点，确保序列正确性和表达框架无误。

二、 pET28a-BCL-2蛋白提取：精准捕获“凋亡卫士”

获得pET28a-BCL-2质粒并转化至表达宿主菌后，智立中特采用标准化的、高效的蛋白提取流程，核心步骤包括：

1. 诱导表达： 将含有pET28a-BCL-2的工程菌在适宜培养基中培养至对数生长期，加入IPTG诱导BCL-2-His融合蛋白大量表达。优化诱导时间（通常3-6小时）和温度（常为30-37°C，有时低温如16-18°C有助于可溶性表达）是关键。

2. 菌体收集与裂解： 离心收集诱导后的菌体，通过物理（超声破碎、高压均质）或化学（酶解、去污剂）方法高效裂解细菌细胞，释放包含BCL-2-His融合蛋白在内的细胞内含物。

3. 离心澄清： 高速离心去除细胞碎片和不溶性物质，获得含有可溶性目标蛋白（BCL-2-His）的上清液。如果BCL-2-His形成包涵体（不溶性聚集体），则需收集包涵体并进行变性和复性处理（此步骤较复杂，我们更倾向于优化条件以获得可溶蛋白）。

4. 亲和层析纯化（核心步骤）： 利用镍柱亲和层析 (Ni-NTA) 技术进行高效捕获和纯化。

   • 结合： 将细胞裂解上清液（或复性后的溶液）上样至已平衡好的镍离子螯合层析柱。BCL-2-His融合蛋白上的6xHis标签与柱上的镍离子(Ni²⁺)发生特异性、高亲和力的结合，而杂质蛋白则流穿。

   • 洗涤： 使用含有低浓度咪唑（竞争性结合镍离子）的缓冲液洗涤柱子，去除非特异性结合的杂蛋白。此步骤可多级优化，逐步提高洗涤严格性。

   • 洗脱： 使用含有高浓度咪唑（通常150-300mM）的缓冲液将紧密结合的BCL-2-His融合蛋白竞争性洗脱下来，获得高纯度的目标蛋白。

5. 脱盐与缓冲液置换： 将洗脱下来的蛋白溶液通过脱盐柱或透析，去除高浓度的咪唑，置换到适合下游应用（如功能研究、结构分析、相互作用实验）的生理缓冲液（如PBS, Tris-HCl）中。

6. 浓缩与定量： 根据需要使用超滤离心管等方法浓缩蛋白溶液，并通过BCA、Bradford等方法准确测定蛋白浓度。

7. 质量控制： 通过SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度和分子量大小，Western Blot 使用抗His抗体或抗BCL-2抗体进行特异性验证。必要时进行质谱鉴定或活性检测。

三、 技术优势与应用价值

• 高表达量： pET系统驱动，可获得毫克级甚至更高产量的重组BCL-2蛋白。

• 高纯度： Ni-NTA亲和层析技术成熟高效，可获得纯度>90%的BCL-2蛋白。

• 便捷性： His标签纯化是应用最广泛的纯化策略之一，操作相对简便快速。

• 灵活性： 可根据研究需求选择保留His标签（便于后续检测或固定化）或通过酶切去除（获得接近天然的BCL-2蛋白）。

• 应用广泛： 提取的高纯度BCL-2蛋白是进行以下研究的宝贵工具：

  • 体外凋亡抑制机制研究

  • 与其他凋亡相关蛋白（如BAX, BAK, BH3-only蛋白）的相互作用分析（Co-IP, Pull-down, SPR, ITC）

  • 药物筛选（寻找靶向BCL-2的抗癌小分子或肽类）

  • 抗体开发与验证

  • 结构生物学研究（X-ray, Cryo-EM, NMR）

结语

BCL-2蛋白作为细胞凋亡通路的关键调控因子，其深入研究对理解生命本质和攻克重大疾病具有不可估量的意义。智立中特（武汉）生物科技有限公司提供的pET28a-BCL-2表达载体及配套的蛋白提取服务，为科研人员提供了高效、可靠、高质量的研究工具。我们致力于通过稳定优质的蛋白产品和完善的技术支持，助力您在细胞凋亡、癌症生物学、药物开发等领域取得突破性进展。选择智立中特，选择精准捕获“细胞凋亡守护者”的钥匙！