解锁高效表达：pcDNA6/V5-His A - 哺乳细胞稳定转染与蛋白纯化的理想载体

一、 载体概述：专为哺乳细胞设计的高效表达平台

        pcDNA6/V5-His A 是由 Thermo Fisher Scientific (原 Invitrogen) 开发的商业化哺乳动物表达载体。它基于 pcDNA™ 系列载体的成熟骨架，整合了 CMV 强启动子、高效的筛选标记以及独特的融合标签系统，旨在实现：

1. 高效转录： 强效的 CMV (巨细胞病毒) 立即早期启动子/增强子 驱动目的基因在多种哺乳动物细胞系中实现高水平转录。

2. 稳定整合与筛选： 载体包含 Blasticidin S deaminase (bsd) 抗性基因。通过添加抗生素 Blasticidin，可高效筛选并获得稳定整合了载体的细胞株，这对于长期表达研究或生产至关重要。

3. 便捷的融合蛋白检测与纯化： 这是 pcDNA6/V5-His A 的核心亮点。它在多克隆位点（MCS）下游融合了：

   • V5 表位标签 (Epitope Tag)： 来源于副粘病毒，具有高度免疫原性，可被多种商业化、高特异性的抗 V5 抗体识别，方便通过 Western Blot、免疫荧光（IF）、免疫沉淀（IP）等方法快速检测目的蛋白的表达和定位。

   • 多聚组氨酸标签 (6xHis Tag)： 由 6 个连续的组氨酸残基组成。该标签能与镍离子（Ni²⁺）或钴离子（Co²⁺）螯合树脂（如 Ni-NTA）发生高亲和力、可逆的特异性结合。这使得利用 固定化金属离子亲和层析 (IMAC) 技术纯化融合蛋白变得极其简单、快速且高效，通常只需一步即可获得较高纯度的目的蛋白。

二、 核心特点与优势

1. 强大的启动子系统： CMV 启动子驱动高水平表达，适用于多种哺乳细胞（如 HEK293, CHO, COS 等）。

2. 高效的 Blasticidin 筛选：

   • 相比 G418 (Neomycin) 筛选，Blasticidin 起效更快（通常 3-7 天），筛选压力更强，能更快获得稳定细胞株。

   • 筛选浓度相对较低，成本效益可能更优。

3. V5/His 双标签系统的黄金组合：

   • 检测无忧： V5 标签提供通用、灵敏的检测手段，抗体选择丰富，背景低。

   • 纯化高效： His 标签是目前应用最广泛、最成熟的亲和纯化标签。IMAC 纯化条件温和（非变性或变性条件均可），操作简便，可规模化，对蛋白功能影响小。纯化后的蛋白可直接用于功能研究、抗体生产、结构分析等。

   • 兼容性好： 双标签位于 C 末端（目的基因插入 MCS 后，表达的是 C 端融合 V5-His 的蛋白），适用于大多数蛋白的表达研究。

4. 载体稳定性好： 成熟的 pcDNA 骨架，在大肠杆菌中复制效率高，易于扩增和提取。

三、 提取与培养流程简述 (针对载体本身)

pcDNA6/V5-His A 载体通常以质粒 DNA 的形式保存在大肠杆菌中（如 TOP10, DH5α 等）。智立中特生物科技可提供高质量的载体质粒或相关服务：

1. 细菌培养与扩增：

   • 将含有 pcDNA6/V5-His A 质粒的大肠杆菌接种于含有 50-100 μg/mL Ampicillin (氨苄青霉素) 的 LB 液体培养基中（载体带有 Amp⁺ 抗性基因）。

   • 37°C, 200-250 rpm 振荡培养过夜 (~16小时)。

2. 质粒提取：

   • 使用商业化质粒提取试剂盒（如碱裂解法小提、中提或大提试剂盒）进行质粒 DNA 的提取和纯化。

   • 关键步骤：裂解、中和、结合、洗涤、洗脱。确保获得高纯度、高浓度的质粒 DNA（OD260/280 ≈ 1.8-2.0）。

   • 智立中特生物科技可提供专业、高效的质粒提取服务，确保您获得符合转染要求的高质量质粒。

3. 质粒定量与质检： 使用分光光度计或荧光计测定质粒浓度和纯度。可通过琼脂糖凝胶电泳验证质粒大小和完整性（pcDNA6/V5-His A 载体大小约为 ~5.2 kb）。

四、 应用领域

pcDNA6/V5-His A 载体广泛应用于：

• 重组蛋白表达与生产： 在哺乳细胞中表达带有 V5/His 标签的功能性蛋白，用于结构、功能研究或小规模生产。

• 稳定细胞系构建： 利用 Blasticidin 筛选建立长期、稳定表达目的蛋白的细胞株，用于药物筛选、信号通路研究、蛋白分泌研究等。

• 蛋白-蛋白相互作用研究： 表达诱饵蛋白，结合 V5 标签进行免疫共沉淀（Co-IP）。

• 亚细胞定位研究： 利用抗 V5 抗体进行免疫荧光（IF）观察融合蛋白在细胞内的分布。

• 抗体开发： 纯化的 V5/His 融合蛋白可作为免疫原生产抗体，或作为阳性对照。

五、 为什么选择 pcDNA6/V5-His A？

• 成熟可靠： 经过多年广泛验证，性能稳定。

• “一站式”解决方案： 强表达、稳筛选（Blasticidin）、易检测（V5）、便纯化（His）集成于单一载体。

• Blasticidin 筛选优势： 速度快，效率高。

• 灵活性： 适用于瞬时转染和稳定转染实验。

结语

pcDNA6/V5-His A 载体凭借其强大的 CMV 启动子、高效的 Blasticidin 筛选系统以及卓越的 V5/His 双标签设计，为科研工作者在哺乳动物细胞中进行基因功能研究、重组蛋白表达与纯化提供了高效、便捷且可靠的平台。无论是构建稳定细胞系，还是快速获得可检测、易纯化的目的蛋白，它都是值得信赖的选择。

智立中特（武汉）生物科技有限公司 致力于为生命科学研究和生物技术产业提供优质的产品与服务。我们深谙 pcDNA6/V5-His A 等核心工具载体的价值，并可提供相关的载体产品、质粒构建、扩增提取以及细胞转染等技术支持与服务。选择智立中特，让我们助您的研究引擎全速运转！