NCI-H1651：如何让这把肺癌研究的“金钥匙”在您实验室发挥最大价值？

          NCI-H1651细胞源自一位53岁白人男性吸烟者的转移性胸膜液，属于非小细胞肺癌（NSCLC）中的肺腺癌细胞系。其核心特征是携带EGFR基因外显子19缺失突变（E746-A750del），对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（如吉非替尼）高度敏感，是研究肺癌靶向治疗及耐药机制的经典模型。

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核心操作指南

一、 细胞复苏

1. 准备： 预热完全培养基（RPMI-1640 + 10% FBS + 1% 青链霉素）至37℃。

2. 解冻： 从液氮/超低温冰箱（-150℃以下）中取出冻存管，迅速置入37℃水浴，轻轻摇动至冰晶完全融化（约1-2分钟）。

3. 转移与离心： 将细胞悬液转移至含5-7mL预热完全培养基的离心管中，轻柔混匀。1000 rpm离心5分钟。

4. 重悬与接种： 弃上清（含DMSO），用新鲜完全培养基轻柔重悬细胞沉淀。接种于培养瓶/皿中，补充适量培养基。

5. 培养： 置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中。复苏后24小时进行首次全量换液，去除死细胞和残留DMSO。

二、 细胞培养

1. 培养基： RPMI-1640 + 10%胎牛血清（FBS） + 1% 青霉素-链霉素双抗溶液。定期更换培养基（通常每2-3天）。

2. 培养条件： 37℃, 5% CO2, 饱和湿度。

3. 传代：

   • 时机： 细胞汇合度达80%-90% 时进行（过度汇合生长受限）。

   • 消化： 弃旧培养基，用PBS轻柔漂洗1-2次。加入适量0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（覆盖瓶底即可），室温或37℃消化约1-3分钟（镜下观察细胞变圆、间隙增大）。

   • 终止： 加入含血清的完全培养基（体积≥胰酶体积2倍），轻柔吹打瓶壁使细胞脱落，形成单细胞悬液。

   • 离心与接种： 收集悬液，1000 rpm离心5分钟。弃上清，新鲜培养基重悬。按1:3至1:6比例接种至新培养器皿（如T25瓶传代可接种2-3个新T25瓶）。

三、 关键操作注意事项

1. 无菌操作： 全程在超净工作台内进行，穿戴实验服、手套、口罩。所有试剂、耗材灭菌。工作台使用前后紫外线照射并用酒精擦拭。

2. 试剂预热： 培养基、胰酶、PBS等使用前需预热至37℃，避免温度休克。

3. 轻柔操作： 吹打、离心、换液动作轻柔，避免机械损伤细胞。

4. 及时传代： 避免细胞过度汇合（>90%），否则易老化、漂浮甚至死亡。

5. 环境稳定： 定期校准培养箱温度、CO2浓度和湿度。避免频繁开关培养箱门。

6. 试剂质量： 使用优质胎牛血清（FBS），不同批次血清需预先测试。

四、 细胞生长状态不佳？排查与解决

1. 污染： 首要怀疑！镜检观察（细菌、真菌），进行支原体检测。若污染，果断废弃并彻底消毒。

2. 培养基/血清问题：

   • 更换新鲜配制的完全培养基。

   • 尝试更换血清批次或提高血清浓度至15-20%（临时）。

   • 确认双抗有效。

3. 消化问题：

   • 消化过度：缩短胰酶作用时间或降低浓度。

   • 消化不足：延长作用时间或增加胰酶量（需摸索）。

   • 胰酶残留：确保加入足量含血清培养基终止，离心去除。

4. 接种密度不当： 密度过低生长缓慢。下次传代提高接种密度。

5. 培养环境异常： 检查并校准培养箱温度、CO2浓度、湿度。确保培养箱内水盘水量充足。

6. 支原体污染： 虽无肉眼可见变化，但严重影响细胞状态。定期检测（如PCR、荧光染色法），阳性则废弃。

7. 细胞老化： 持续传代可能导致特性改变。启用低代次冻存细胞。

五、 污染预防：重中之重！

1. 严格无菌： 这是核心！遵守所有无菌操作规程。

2. 专用试剂： 培养基、胰酶、PBS等分装使用，避免反复温热。开封后标注日期。

3. 定期检测： 每月至少进行一次支原体检测。

4. 环境清洁： 定期清洁消毒培养箱、水浴锅、超净台及实验室环境。

5. 操作规范： 避免双手跨越开放容器上方。移液器、枪头避免触碰非无菌面。

6. 及时处理： 发现可疑污染（培养基浑浊、pH异常改变、镜下异常物），立即隔离该培养器皿，尽快鉴定。确认污染后彻底灭菌废弃，并对相关区域严格消毒。

六、 细胞冻存

1. 时机： 选择对数生长期、状态良好的细胞（汇合度80%左右）。

2. 准备冻存液： 配制含10% DMSO的完全培养基作为冻存保护液，置于冰上预冷。

3. 细胞处理： 按常规方法消化收集细胞，离心后弃上清。

4. 重悬： 用预冷的冻存液轻柔重悬细胞，调整密度至 5×10^6 至 1×10^7 cells/mL。

5. 分装： 迅速将细胞悬液分装至标注清晰的冻存管中（通常1-1.5mL/管）。

6. 程序降温：

   • 推荐： 使用程序降温盒（如Mr. Frosty），置于-80℃冰箱过夜（约以1℃/min速率降温），次日转入液氮气相或液相长期保存。

   • 替代： 将冻存管依次置于4℃（30min）、-20℃（1-2h）、-80℃（过夜或更久），再转入液氮。此法效果略逊于程序降温盒。

7. 记录： 详细记录冻存日期、细胞名称、代次、密度、位置等信息。

七、 细胞鉴定

1. STR分型： 金标准方法。通过检测细胞基因组中特定短串联重复序列（STR）位点，与ATCC或原始来源数据库进行比对，确认细胞株身份唯一性，排除交叉污染。智立中特强烈建议客户定期进行STR鉴定（尤其在长期培养后或关键实验前）。

2. 支原体检测： 定期进行（如每月或每季度），确保无支原体污染（常用方法：PCR法、Hoechst荧光染色法、培养法）。

3. 形态学观察： 在倒置显微镜下观察细胞形态（NCI-H1651通常呈上皮样，贴壁，可成簇生长），作为基础判断。

4. 生长特性： 评估其增殖速度、贴壁能力是否符合预期。

5. 基因突变验证： 通过测序（Sanger或NGS）或特异性检测方法（如ARMS-PCR）确认EGFR外显子19缺失突变的存在。

八、 核心作用与研究价值

NCI-H1651细胞的核心价值在于其明确的EGFR E746-A750del驱动突变，使其成为研究以下领域的关键工具：

• EGFR-TKIs作用机制： 研究吉非替尼、厄洛替尼等药物抑制EGFR信号通路的分子机制。

• 获得性耐药机制： 模拟临床耐药发生过程，研究如T790M突变、MET扩增、表型转化等耐药机制。

• 新型靶向药物开发与评价： 测试新一代EGFR-TKI（如奥希替尼）、联合用药方案的有效性。

• 肺癌基础生物学研究： 探索EGFR信号网络、细胞增殖、凋亡、迁移侵袭等过程。

• 药物敏感性/耐药性筛查平台： 用于高通量筛选潜在抗癌化合物或联合疗法。

九、 应用领域

1. 肿瘤分子生物学研究： EGFR信号通路、肺癌发生发展机制、癌基因成瘾性。

2. 抗肿瘤药物研发：

   • 新型EGFR抑制剂单药或联合用药的体外药效学评价。

   • 克服EGFR-TKI耐药的新策略（新药、新靶点、新组合）研究。

3. 肿瘤耐药机制研究： 建立获得性耐药模型，深入解析耐药发生的遗传和表观遗传基础。

4. 生物标志物研究： 寻找预测EGFR-TKI疗效或耐药的生物标志物。

5. 癌症精准医疗模型： 作为具有明确驱动基因突变的体外模型，服务于个体化治疗策略的探索。

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