智立中特E.coli W3110DE3培养方法详解

E.coli W3110DE3 菌株培养方法

菌株特性：

• W3110 衍生菌株，携带 λDE3 溶原基因（含 T7 RNA 聚合酶），适用于 T7 启动子控制的蛋白表达。

• 基因型：F⁻, λ⁻, rph-1, invB, gal, Δ(araABC-leu)7697, ΔlacX74, ΔphoA, ΔuvrB, ΔompT, degP41, kanR, DE3

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一、培养基制备

1. LB 培养基（常规培养）

   • 组分：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L，NaCl 10 g/L

   • 配制：溶解后调节 pH 至 7.0~7.4，121℃ 高压灭菌 20 分钟。

   • 抗生素：根据载体抗性添加（如氨苄青霉素 100 μg/mL，卡那霉素 30 μg/mL）。

2. TB 培养基（高密度培养）

   • 组分：胰蛋白胨 12 g/L，酵母提取物 24 g/L，甘油 4 mL/L，KH₂PO₄ 2.31 g/L，K₂HPO₄ 12.54 g/L

   • 灭菌后加入过滤除菌的 MgSO₄（终浓度 2 mM）。

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二、培养步骤

1. 菌种复苏

• 从 -80℃ 甘油保存菌种中取 10 μL，划线于含抗生素的 LB 琼脂平板。

• 37℃ 倒置培养 12~16 小时，挑取单菌落。

2. 种子液制备

• 挑取单菌落接种至 3~5 mL 含抗生素的 LB 液体培养基。

• 37℃、200 rpm 震荡培养 6~8 小时（OD600 ≈ 1.0~1.5）。

3. 扩大培养

• 按 1:100 接种至新鲜培养基（LB 或 TB），37℃、200 rpm 震荡培养至 OD600 = 0.6~0.8（约 2~3 小时）。

4. 诱导表达（如需）

• 加入 IPTG 至终浓度 0.1~1.0 mM（根据蛋白毒性优化）。

• 诱导条件：

  • 可溶性蛋白：25℃、150 rpm 诱导 16~20 小时

  • 包涵体：37℃、200 rpm 诱导 4~6 小时

5. 菌体收获

• 4℃、6000×g 离心 10 分钟，弃上清。

• 菌体重悬于 PBS 或裂解缓冲液，-80℃ 保存备用。

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三、关键注意事项

1. 抗生素添加：培养基冷却至 50℃ 以下后加入抗生素，避免失活。

2. OD600 监测：避免 OD600 > 1.0 时诱导，以免代谢副产物抑制蛋白表达。

3. 通气控制：摇瓶装液量 ≤ 20% 体积，确保充足氧气。

4. 污染排查：定期镜检菌体形态，确认无杂菌污染。

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四、菌种保存

• 短期保存：穿刺接种 LB 琼脂斜面，4℃ 保存 1~2 个月。

• 长期保存：菌液与 50% 甘油等体积混合，-80℃ 保存（终浓度 25% 甘油）。