细胞传代培养详解：从贴壁到悬浮的各种方法技巧

　　在生物医学实验中，细胞系是不可或缺的，因为它们能够迅速生长和扩增，为实验分析提供必要的细胞。尽管细胞系与新分离或原代细胞的培养条件相似，但它们也有一些独特之处。每个细胞系都需要特定的生长因子混合物，并且由于其无限生长的突变特性，它们的生长需要更加严密的监控，以防止过度生长。当细胞系生长至培养器皿底部的90%密度时，就需要进行重悬洗涤、实验或冻存等处理，或者重新接种到新的培养器皿中以进一步扩增。

　　1.细胞传代基础知识

　　【贴壁与悬浮细胞的培养及转移】

　　细胞传代或续代培养是细胞生物学中的一项关键技术，它涉及将细胞从现有培养物中分离并开始新的培养过程，同时加入新鲜的培养液以促进细胞的扩增。尽管这一过程的概念相对简单，但成功保存和扩增细胞系需要掌握一系列重要的步骤和技术。该部分介绍了如何通过适当的试剂和仪器安全地转移贴壁细胞，并将它们转移到新培养液中以实现细胞扩增。此外，还展示了悬浮培养与贴壁培养的区别及应用实例。

　　【培养液的监控与更换原则】

　　在细胞传代过程中，需要遵循一些基本原则。随着细胞培养的进行，培养液中会逐渐累积代谢产生的有毒物质。因此，定期更换培养液对于维持细胞的健康状态至关重要。同时，密切监测细胞的扩增情况也是必不可少的，以防止细胞过度生长。本节重点强调培养液中累积的代谢废物对细胞健康的影响，介绍通过观察培养液颜色变化来判断是否需要更换培养液的重要性，以及在培养过程中保持培养液新鲜的重要性。

　　【不同的细胞系及培养方式】

　　传代的细胞通常可以分为两大类：永生化细胞系和干细胞系。永生化细胞系是通过突变修饰改变细胞周期调控而获得无限繁殖能力的细胞，例如著名的HeLa细胞系。与之相对，干细胞系则是从成人和胚胎组织的自我更新多能细胞中分离得到的，如人类胚胎干细胞，在适当的条件下也能进行无限传代培养。强调了永生化细胞系与干细胞系的不同特征及培养需求，提及了不同细胞来源和特点下的培养方法，并详细介绍了一些常用培养板及瓶的适用情境。

　　【细胞传代的关键步骤和注意事项】

　　在处理贴壁细胞时，首要步骤是去除细胞与塑料表面结合的蛋白。这通常通过使用消化酶胰酶来完成。然而，控制胰酶消化的时间至关重要，因为过长的处理时间会损害细胞表面的关键蛋白。细胞培养液被用来中和胰酶，因此在胰酶消化之前，细胞常先用磷酸缓冲液或PBS进行洗涤。此外，EDTA这样的钙螯合剂有时也会被用来增强胰酶的蛋白水解能力。详细说明了传代操作中的关键步骤，包括无菌技术、胰酶消化的控制、细胞计数与接种等，同时提供了一些可以实现快速且可重复扩增的技术方案与工具。

　　为了扩增细胞克隆，新传代的细胞会被置于细胞培养箱中，其中温度维持在37℃，二氧化碳浓度为5%，湿度为95%，这些条件均需根据特定细胞的生长需求进行精细调整。

　　接下来是传代细胞的步骤。首要任务是确定细胞监测的频率，这主要取决于细胞的扩增速度。同时，还需观察培养液的颜色以及其他生长指标，如培养液的浑浊度、细胞的大小和密度，以及细胞的总体健康状况。当细胞密度达到约90%时，便可进行传代。此时，需移除旧的培养液，用无钙离子和镁离子的磷酸缓冲液洗涤细胞，然后加入胰酶进行消化。将细胞置于37℃下消化约5分钟，待确认细胞已从培养板壁脱落后，立即加入新鲜细胞培养液以终止胰酶的水解反应。随后，将悬浮的细胞转移到锥形管中进行离心。离心后，小心移除上清液，重悬细胞于新鲜的培养液中。之后，对收集到的细胞进行计数，并根据适当的密度进行接种，以立即启动细胞的扩增过程或为将来的扩增做准备。

　　此外，还有一些特殊的传代技术值得注意。例如，人胚胎干细胞这类必须传代的细胞，通常与小鼠成纤维细胞MEF共同培养。当干细胞发育到合适阶段时，需要将其从饲养细胞上挑出并接种到新的培养液中进行扩增。对于某些对酶消化敏感或贴壁紧密的细胞系，可以使用细胞刮来轻轻将细胞从培养板底部刮下。若细胞贴壁特别紧密，则可在加入适当溶液后用血清吸管用力刮擦。但需注意，这种方法可能会对脆弱细胞造成损害，因此使用时需格外小心。

　　为了实现快速且可重复的大量细胞扩增，超出单层培养瓶的容量限制，可以采用多层培养瓶。这类培养瓶的设计使得培养量能达到单层培养瓶的3至5倍。