智立中特生物 USDA 6大豆慢生根瘤菌培养细节说明

一、菌种基本信息

1. 菌种名称：大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum USDA 6）

2. 特性：

   • 专一性宿主：大豆（Glycine max）及部分豆科植物。

   • 功能：与大豆根系共生形成根瘤，将空气中氮气转化为植物可利用的铵态氮。

   • 生长特性：慢生型，代时较长（约6-12小时），需氧或微好氧。

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二、培养基制备

推荐培养基：酵母提取物-甘露醇（YEM）培养基

1. 配方（每升蒸馏水）：

   • 酵母提取物：1.0 g

   • 甘露醇：10.0 g

   • 磷酸氢二钾（K₂HPO₄）：0.5 g

   • 硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）：0.2 g

   • 氯化钠（NaCl）：0.1 g

   • 碳酸钙（CaCO₃）：3.0 g（调节pH并防止酸化）

   • pH值：6.8-7.2（灭菌前用1M NaOH或HCl调节）

2. 灭菌条件：

   • 121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

   • 注意：碳酸钙需单独灭菌后加入，避免高温结块。

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三、菌种活化与扩大培养

1. 菌种活化（斜面培养）

• 步骤：

  1. 从保存的甘油管或冻干粉中取菌种，划线接种至YEM固体斜面培养基。

  2. 28℃恒温培养箱中避光培养5-7天，直至菌落形成（乳白色、半透明、边缘光滑）。

  3. 4℃短期保存（≤1个月），长期保存需置于-80℃甘油管中。

2. 液体扩大培养

• 步骤：

  1. 挑取斜面菌落接种至50 mL YEM液体培养基（250 mL锥形瓶），28℃、150 rpm振荡培养5-7天。

  2. 按1%-2%接种量转接至新鲜培养基中，扩大培养至目标体积（如1-5 L）。

• 关键参数：

  • 溶氧量：振荡培养时确保通气良好，但避免过度泡沫（可添加消泡剂）。

  • 菌浓检测：OD600值达0.8-1.2时停止培养（活菌数≥1×10⁹ CFU/mL）。

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四、质量控制与检测

1. 纯度检测：

   • 革兰氏染色：阴性，短杆状。

   • 平板划线：观察菌落形态单一，无杂菌污染。

2. 功能验证：

   • 结瘤试验：接种灭菌后的大豆幼苗，7-14天后检查根瘤形成（有效根瘤呈粉红色）。

   • 固氮酶活性检测：乙炔还原法（ARA法）测定固氮效率。

3. 分子鉴定：

   • 通过16S rRNA或nodC基因PCR扩增确认菌株特异性。

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五、菌剂制备与应用

1. 载体吸附法（推荐）：

   • 将液体培养物与灭菌泥炭土（或腐殖酸载体）按1:1比例混合，调整含水量至30%-40%。

   • 28℃避光后熟24小时，使菌体充分吸附。

2. 应用方法：

   • 种子包衣：按1:50比例（菌剂:种子）拌种，阴干后播种。

   • 土壤接种：每亩施用500-1000 g菌剂，与土壤混匀后播种。

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六、储存与运输

1. 短期保存：4℃避光储存，有效期3个月。

2. 长期保存：

   • 添加15%甘油，分装至冻存管，-80℃保存（有效期≥2年）。

3. 运输要求：低温（4-10℃）避光运输，避免反复冻融。

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七、注意事项

1. 无菌操作：全程需在超净工作台中进行，避免杂菌污染。

2. 避免高温：培养温度不可超过30℃，否则菌体活性下降。

3. 宿主匹配性：仅适用于大豆及指定豆科作物，其他作物无效。