小鼠BMSCs永生化及GFP标记培养步骤

小鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的永生化及GFP标记培养步骤如下：

1. 材料准备

• 细胞系：永生化小鼠BMSCs

• 培养基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 青霉素/链霉素

• GFP载体：如pEGFP-N1

• 转染试剂：如Lipofectamine 3000

• 筛选抗生素：如G418

2. 细胞培养

1. 复苏细胞：从液氮中取出细胞，37°C水浴解冻，离心后重悬于培养基，接种于培养瓶。

2. 培养条件：37°C、5% CO₂培养箱中培养，每2-3天换液一次。

3. 传代：细胞达80-90%融合时，用胰酶消化后按1:3比例传代。

3. GFP转染

1. 准备细胞：转染前一天将细胞接种于6孔板，密度为50-70%。

2. 转染复合物制备：将GFP载体与转染试剂按比例混合，室温孵育15-20分钟。

3. 转染：将复合物加入细胞培养孔，轻轻混匀后继续培养。

4. 筛选：转染48小时后，加入G418筛选，持续2-3周，直至稳定表达GFP的细胞群形成。

4. GFP阳性细胞筛选

1. 流式细胞术分选：使用流式细胞仪分选GFP阳性细胞。

2. 扩大培养：将分选后的细胞继续培养，确保GFP表达稳定。

5. 细胞鉴定

1. 形态观察：确认细胞形态符合BMSCs特征。

2. 表面标志物检测：通过流式细胞术检测CD44、CD90等标志物。

3. 分化能力检测：进行成骨、成脂分化实验，验证分化潜能。

6. 冻存

1. 冻存液制备：培养基 + 10% DMSO + 20% FBS。

2. 冻存：将细胞悬液分装至冻存管，程序降温后转入液氮长期保存。

注意事项

• 无菌操作：全程保持无菌。

• 细胞状态：定期检查细胞状态，避免污染和老化。

• GFP表达：定期检测GFP表达，确保稳定性。

通过这些步骤，可以获得稳定表达GFP的永生化小鼠BMSCs，用于后续实验。

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