Caco-2人结直肠腺癌细胞基本信息及培养攻略

　　01、细胞基本信息

　　细胞名称：Caco-2(人结直肠腺癌细胞)

　　细胞别称：CaCo-2;CACO-2;Caco 2;CACO 2;CACO2;CaCo2;CaCO2;Caco2;Caco-2/ATCC

　　细胞货号：SNL-068

　　生长特性：贴壁

　　培养条件：DMEM+20%FBS+1%P/S

　　培养环境：空气，95%；二氧化碳(CO2)，5%；37℃

　　细胞简介：Caco-2细胞分离自一名72岁结肠腺癌白人男性患者直肠原位癌。当长到满时，Caco-2细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达热稳定肠毒素（Sta，大肠杆菌）、表皮生长因子（EGF）、维生素A酸结合蛋白I和视黄醇结合蛋白II，并呈角质蛋白阳性。Caco-2细胞可以用于3D细胞培养、高通量筛选、癌症研究和毒理学研究，也是一种合适的转染宿主。

　　02、Caco-2细胞培养注意事项

　　1、空泡现象

　　密集较高时，Caco-2细胞中可见巨大的空泡，这是该细胞正常特性，无需担心。

　　2、消化时间长

　　Caco-2贴壁紧，细胞间连接紧密，细胞容易成片脱落。传代时，建议分次消化（详细步骤见下文）该细胞难以消化成单个细胞，脱落后将细胞吹打成小团即可终止消化。

　　3、贴壁较慢

　　传代或复苏之后，Caco-2需要48小时左右才能完全贴壁。建议将细胞接种至培养器皿后，放进培养箱耐心等待48小时再拿出培养瓶观察，更有利于细胞贴壁。此外还需注意血清对贴壁的影响，血清的比例低于20%时，Caco-2细胞贴壁时间延长，甚至不贴壁。

　　4、生长缓慢

　　80%密度1:2传代的前提下，Caco-2通常需要培养5-7天再传代。

　　03、Caco-2细胞传代方法

　　1.准备所需的培养基、胰酶、PBS、离心管、培养瓶以及无菌枪头等；（试剂提前预热）

　　2.抽走培养瓶内培养基，加5mL PBS润洗1-2遍，清除残留培养基；

　　3.尽量吸干润洗的PBS后加1mL胰酶，摇晃使胰酶均匀覆盖瓶底，放置培养箱37℃消化；

　　4.消化时，每隔3-5min拿出来观察，直到部分细胞边缘开始脱落时，吸取正在消化的胰酶吹打细胞收集到装有3-4mL完全培养基的离心管中，此时瓶底还有部分细胞未被吹下（若细胞已经全部被吹下，直接进行第6步）；

　　5.加1mL新的胰酶到培养瓶，放进培养箱继续消化瓶中剩下的细胞，直到轻拍培养瓶细胞可以脱落，立即加入1mL含血清的培养基终止消化，转移到上一步的离心管中；

　　6.轻柔吹打离心管中细胞悬液，使细胞分散；

　　7.1000rpm，3min离心收集细胞；

　　8.在新的培养瓶中加入适量新鲜培养基；（T25推荐10mL，T75推荐15mL）；

　　9.离心完成后，弃上清，加入适量新鲜培养基轻轻重悬吹散细胞，将细胞悬液均匀接种至培养瓶中，十字法或8字法混匀，然后放入培养箱中继续培养48小时再观察，注意培养瓶盖透气。

　　04、Caco-2细胞冻存方法

　　1.配制程序性冻存液，准备相应数量冻存管并做好标记。

　　推荐冻存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完全培养基+8%DMSO

　　2.先将细胞按传代步骤消化、离心、弃上清，获得细胞沉淀；

　　3.加入适量程序性冻存液轻轻重悬细胞，并将细胞悬液转移至冻存管中；

　　4.将冻存管放入程序性冻存盒，放入-80℃冰箱过夜；

　　5.转移冻存细胞至液氮保存并登记细胞保存位置

　　液氮保存24h后建议复苏一管检测冻存细胞的活性，若活性合格即可长期保存。

　　程序性冻存液需要配合程序性冻存盒使用，若使用非程序冻存液请按产品说明书处理降温过程。

　　T25培养瓶长满通常可冻存2-3管，10cm皿长满通常可冻存3-4管。

　　冻存密度低将导致复苏后细胞状态不佳。

　　05、Caco-2细胞复苏方法

　　1.提前将水浴锅预热至37℃，培养基复温至室温或37℃，离心机设置好转速；

　　2.将细胞从液氮罐取中出，观察管内无液氮的情况下，捏住管盖，将细胞冻存部分浸入水浴锅迅速摇晃，细胞融化至米粒大小冰块时终止水浴，融化过程不超过2min；

　　若液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。

　　冻存管在液氮长期保存过程中难免渗入液氮，取出细胞时震动不要过大。水浴前一定要观察管内是否存在液氮，若有液氮需静置一会待液氮完全蒸发后再水浴。做好防护，避免冻存管炸开导致受伤。

　　水浴时使用一次性PE手套包住冻存管避免直接接触水源，避免污染。

　　3.直接将冻存管以离心力150g(约900rpm)左右离心2min，不同离心机具体转速会有差异

　　4.离心完成后弃上清，用预热的培养基缓慢加入冻存管，轻柔重悬细胞后接种至培养瓶中，轻轻混匀后放入培养箱；

　　5.复苏48小时后观察，若细胞已贴壁，换液一次，放回培养箱继续培养。若细胞未贴壁，继续培养24小时再观察。

　　1.整个细胞复苏过程在尽可能5-10min内完成。

　　2.该细胞贴壁需要稳定的环境，复苏完成后请勿频繁将细胞拿出观察。

　　06、Caco-2细胞培收货攻略

　　常温细胞

　　1.收货后，拆开外包装，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培养箱静置4h以上；

　　2.吸走大部分培养基并留10-12 mL，显微镜下拍照保存细胞状态照片，观察细胞密度，若细胞密度大于80%即可按比例传代（首次传代比例建议1：2），若细胞密度低于70%可以留10-12 mL继续培养至细胞密度80%以上再进行传代培养；

　　冻存细胞

　　1.细胞收货后尽快开箱检查，若干冰充足可以取出细胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天内复苏）短期保存或液氮中长期保存，若干冰完全挥发建议立即复苏细胞并联系销售人员解决；

　　2.冻存细胞建议尽快复苏一管培养检查，以免超出售后期，复苏步骤参考复苏攻略；

　　3.复苏一管细胞出现异常及时联系销售人员，在专业技术支持的指导下进行下一步操作；

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