血清在细胞培养中的作用及使用时的常见问题

　　血清简介

　　血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。其中牛血清是重要的细胞培养添加成分，具有终止胰蛋白酶消化，提供细胞生长所需的贴壁因子、免疫球蛋白、胰岛素等其他营养物质的作用。

　　血清的分类和区别

　　根据采血时间的不同，牛血清通常分为胎牛血清（FBS)、新生牛血清(NCS)、小牛血清（BCS）、供体血清。

　　其主要区别为：

　　（1）采血方式不同

　　胎牛血清：母牛怀孕3-8个月时，采用剖腹心脏密闭穿刺取血

　　新生牛血清、小牛血清、供体牛血清：分别是取自新生牛（小牛）、成牛的血。

　　（2）血清成分不同

　　胎牛血清还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少；促细胞生长因子、促附因子、激素及其他活性物质等组分也不同于其他几类血清。

　　（3）用途不同

　　某些细胞的培养必须使用胎牛血清才行，如：干细胞、淋巴细胞、神经细胞等；而有些细胞需要小牛血清就可以，如：肿瘤细胞等。使用浓度也不同，一般在10%-15%，有特殊要求的浓度在20%。

　　（4）颜色不同

　　血清根据血红蛋白含量的不同，表现的颜色也不一样，真正的胎牛血清凝血功能差，红细胞容易破裂，一般表现出微红色或橘色；而新生牛（小牛）血清则表现为蜡黄色或偏黄色。

　　（5）澄清度和粘稠度不同

　　胎牛血清蛋白和脂类含量低，表现为稀薄、清淡，新生牛（小牛）血清相比更加粘稠。

　　理论上，优质的胎牛血清在细胞培养方面通常优于其他类型的血清，与新生牛和小牛血清相比，各类生长因子含量更为丰富。但是由于胎牛血清价格相对而言会更高一些，不同实验对于血清的需求也不同，因此要综合考虑各实验室、生产企业的条件与所培养细胞类型，除了以往根据经验和文献报道，必要时也可进行针对特定细胞的血清筛选试验，以筛选出最佳血清。

　　血清的选择

　　01.中国海关允许进口的血源地

　　世界动物卫生组织（OIE）对国家或地区动物感染性疾病有相关评价指标，如疯牛病风险评价指标GBR就是根据疯牛病风险等级进行地域性风险评估及分类。

　　目前世界上仅有一些少数国家在OIE对牛类风险性疾病的评估中符合中国海关要求，因此中国海关允许进口的血清来源地有澳大利亚、新西兰、乌拉圭等，这些国家来源的牛血类制品的生物安全等级较高，科研人员在使用相关来源的血类制品时极大降低了感染疾病的风险。

　　2.严格质控

　　由于牛血清在人科学研究和生物制药生产中非常重要，很多国家都将其纳入药典，在我国的中华人民共和国药典Ch.P中规定了牛血清的定义和质量标准，如内毒素、总蛋白含量、血红蛋白、PH、微生物、免疫球蛋白、抗生素等。

　　此外，9种牛类传染性疾病的检测结果也十分重要，分别是牛呼吸道融合病毒(BRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛细小病毒(BPV)、蓝舌病毒(BTV)、牛腺病毒(BAdV)、狂犬病毒(RABV)和呼吸道肠道病毒(REO)等，这些病毒部分是人畜共患病，病毒检测不合格的血清甚至会影响科研人员的健康与安全。因此我们要选择质控标准严格按照药典要求，并遵循cGMP规范生产流程的血清供应商，可在血清生产等各个环节保证产品质量。

　　3.批间差异小

　　血清批间差是客观存在的，因为血清制品来源于天然活体，供体牛的生理状况、健康状况均不同，且受饲养环境的地形、风貌、饮食、水源等影响，体内各类蛋白、生长因子和酶类的含量均有巨大差异，所以血清具有含量复杂且不固定的特性，批间差异在所难免，因此批间差异小的血清不仅可以保证血清质量，确保细胞培养效果，还能减少由于批间差异带来的使用前测试，且避免实验结果的不可重复性。

　　而相同品牌的胎牛血清，在蛋白质含量等方面，也可能会存在批次差异，因此在同一实验中最好使用来自同一批次的血清，以减少变异性。如果不得不使用不同批次的胎牛血清，请进行验证实验以确保结果的可重复性。

　　血清保存方法

　　血清在生产制备完成后，通过质量检测，然后被运送至市场上销售。整个过程中，包括运输流程，储存温度应严格保证在-20℃，避免反复冻融影响血清活性。

　　实验人员在收到血清，检查完好后，及时将血清送至-20℃冰箱中储存，用时再取出解冻。如果一次无法用完一瓶，应该无菌分装后冷冻保存。注意避免反复冻融。

　　血清解冻方法

　　将血清首先置于冰箱2-8℃中12-24小时，使之缓慢部分溶解，然后再放在室温下使之全溶。注意：溶解过程中要每隔一段时间缓慢地摇动血清使之混匀。切记：避免37℃水浴。另解冻后的血清，不宜在4℃冰箱中放置过久。

　　血清的使用及常见问题（FAQ）

　　Q1.血清中的沉淀是什么？

　　用于细胞培养的各种血清产品中都存在各种类型的沉淀。除了胆固醇和一些蛋白沉淀之外，血清中也会含有纤维蛋白和磷酸钙，但在细胞培养应用方面，沉淀一般不会对血清的性能产生影响。

　　（1）纤维蛋白

　　肉眼可见的较大物质，可达1-2mm。血清是在低温条件下收集并迅速加工处理，导致一些纤维蛋白原仍存在于溶液中。虽然过滤去除了绝大部分的纤维蛋白，但解冻过程中，纤维蛋白原会再次转化成纤维蛋白析出，形成沉淀。

　　（2）磷酸钙

　　一种常见的沉淀物，表现为云状。通过倒置显微镜观察，会发现许多小黑点。由于布朗运动，这些黑点可自由移动，因此常被误认为是细菌污染。

　　（3）其他

　　胆固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白质。

　　Q2.血清沉淀是污染吗？

　　无论是较大的絮状纤维蛋白还是小黑点样的磷酸钙，都容易被误认为是细菌污染，但其实血清沉淀并不一定是污染。

　　由于在37℃的温度下培养，会加剧纤维蛋白的析出和磷酸钙颗粒产生，可采用空培方式验证污染，血清按所需比例加入无菌培养基中（不加双抗），放培养箱中过夜，观察空培外观，若为澄清，则血清无污染。还可以通过将血清接种在细菌培养基上进行培养，观察是否存在细菌增殖，并且进行革兰氏染色，用油镜观察直接判断是否为微生物污染。

　　Q3.血清沉淀会影响细胞生长吗？

　　血清出现沉淀是血清的正常特性，各大品牌的血清均有沉淀的出现，过于澄清的血清并不代表更高的品质，也可能是在加工过程中提前进行“预老化”，即反复冻融尽可能的去除纤维蛋白原的结果。血清沉淀的多少与血清的使用效果没有必然关系，血清沉淀并不会影响细胞的正常生长。

　　Q4.血清沉淀增多的原因

　　①血清热灭活；

　　②37℃孵育；

　　③频繁的解冻与冻存操作；

　　④解冻过程中未混合；

　　⑤经γ-辐照；

　　⑥2-8℃长时间储存；

　　Q5.去除沉淀的方法

　　如果血清中含有沉淀，若去除这些絮状沉淀物，可将血清分装至无菌离心管中，以3000rpm离心5-15min，去除大颗粒沉淀，收集上清液加入培养基内一起过滤。

　　Q6.如何判断血清污染？

　　（1）首先检查并判断外包装是否有破损，一般瓶身破损的血清发生污染的可能性极大；

　　（2）将血清接种到细菌/真菌培养基上，培养后看是否有菌落形成；

　　（3）可通过质量检测试剂盒检测结果判定，如支原体检测试剂盒等。

　　血清污染主要包括细菌污染、真菌污染和支原体污染。在细胞培养时如存在细菌污染，可尝试使用5-10倍浓度青链霉素双抗冲击培养24-48h；真菌污染的细胞无法抢救，应立即将细胞瓶进行高压灭菌处理，并彻底消毒培养箱；支原体污染可考虑更换早期代次细胞，或使用商品化支原体去除试剂。

　　Q7.血清中的小黑点是“黑胶虫”么？

　　血清解冻过程温差过大、经反复冻融或通过热灭活处理后更容易产生沉淀，这些沉淀物在镜下观察时有一些会呈现以布朗运动的小黑点，业内流行一种“黑胶虫”污染的说法，但“黑胶虫”一直以来都是极为神秘的存在，至今科学家们也没有完整的实验结果可以证实它究竟是一种生物还是非生物，更有人认为“黑胶虫”是血清的原虫，或误以为是细菌或真菌污染。

　　但科学家通过进一步的研究发现它们更可能是血清中的蛋白结晶。这种结晶可能为蛋白析出，如纤维蛋白原凝结成纤维蛋白；或是盐析出，如磷酸钙等；也有一些是胆固醇和脂肪酸。

　　Q8.培养基中添加血清和抗生素后可长期保存吗?

　　新鲜培养基中添加血清和抗生素后，建议在2周内使用完。

　　Q9.如何做血清的梯度替换？

　　当细胞培养实验需更换血清品牌时，做程序性梯度替换方案尤为重要，因为不同品牌的血清所含成分有所差异，血清更换会使细胞发生不适，从而出现细胞增殖缓慢或细胞状态不佳等情况。

　　建议的梯度替换方法为：完全培养基配置过程中先用20%新血清与80%原血清进行混合，培养传代1-2次；而后用50%新血清与50%原血清混合培养传代；再用80%新血清与20%原血清混合培养传代；最后完全使用新血清培养传代。

　　Q10.血清的热灭活是必须的吗?

　　血清进行热灭活的目的是，利用较高的温度使补体失活。由于胎牛血清会严格控制采血时间为3-8月龄的胎牛，此时还未形成完整的补体系统，因此，合格的胎牛血清，是不需要灭活的。

　　实验表明，经热灭活处理的血清对细胞生长可能仅有微小促进或完全没有任何作用，甚至通常因高温处理而损失掉血清中部分营养成分从而影响血清质量，造成细胞生长速率降低。

　　热灭活过程中因局部温度过高、摇晃不均匀或灭活时间过长，会造成血清品质下降，且经热灭活后的血清会增加发生蛋白沉淀概率。因此，若非必须血清不需要做热灭活。

　　如您的实验对血清中的某种组分敏感，需要去除该组分。最常见的情况是需要去除血清中的补体蛋白，因为补体在机体中参与细胞杀伤，巨噬细胞和淋巴细胞活化，肥大细胞和血小板组胺释放，平滑肌收缩等过程，所以一般在免疫学相关研究中及肌细胞和干细胞的培养过程，可酌情对血清进行热灭活操作。

　　Q11.如何进行血清灭活处理？

　　血清请先按上述血清解冻方法中的操作步骤融化和混匀，热灭活时请将血清置于56℃水浴30分钟。

　　为尽量减少热灭活对血清品质的影响，一次灭活的血清体积不宜过大。最好准备同样的容器装相等体积的水（与血清相同温度），灭活时将装有血清和水的容器同时放入56℃水浴,在装水的容器中放置温度计，加热过程中不时轻轻旋转混匀血清，当温度计显示达到56℃左右，开始计时。56℃水浴后，建议马上转移到冰上降温。

　　Q12.除了对血清进行质控检测，还有何更直观的方式分辨血清质量呢？

　　我们可根据血清的颜色，沉淀，澄清度等进行目测法区分。

　　颜色：颜色根据血清蛋白含量的不同，可表现出黄色或者红色。进口血清质量最好的呈现出淡黄、微红色，较差质量呈现出橘红色或鲜红色。热灭活血清或保存不当的，由于血红蛋白的破坏氧化，会呈现出暗红色，甚至咖啡色。

　　沉淀：血清中的沉淀主要是有纤维蛋白的凝聚产生。沉淀产生的原因很多，使用时反复冻融会增加沉淀，进口血清过滤分装前很少反复冻融。

　　澄清度：进口血清是由于蛋白和脂类等物质含量低，表现为稀薄、清淡。国产血清绝大多数为新生牛血清，相对而言更加粘稠，颜色略深。

　　Q13.细胞生长状态异常等情况是否与血清有关？

　　细胞形态异常需要综合考虑细胞代次、培养操作、培养基和血清等诸多因素。如培养操作不当导致的机械损伤或者消化过度等都有可能影响细胞的生长状态。有些细胞对血清具有一定适应性，更换新批次血清时可能出现所含因子水平的差异而导致的细胞生长状态受到影响的现象，可以通过血清梯度替换或者增加细胞适应时间来解决此类问题。与此同时也要关注细胞操作培养等其他方面是否存在一定问题。