细胞冻存后成活率不高？原来问题在这！

　　冻存的细胞总是受损？细胞冻存效果不佳会影响后续细胞复苏，进而影响整个实验的进度。今天，小编为大家总结了细胞冻存的5个常见问题和相应的解决办法供各位科研人员参考

　　主要问题及解决方案

　　①如何保存细胞冻存液？

　　冻存液可以用90%血清加10%DMSO，保存时间更长。DMSO配制时会放热，配好后应放进冰箱冷却，避免细胞因温度过高而死亡，且DMSO有吸湿性，建议将其储存于干燥环境中。

　　②冷冻管应如何解冻？

　　将细胞从液氮中取出，置于-80℃的冰箱中数分钟。等待管中液氮完全挥发后，再放入37℃的水浴锅中，防止温度相差过大导致冷冻管爆裂。轻轻摇动冻存管，使其在2分钟内全部融化。在过程中需注意水面不可高于冻存管管口，否则容易造成污染。

　　③冻存的最佳时间？

　　细胞应在生长良好、培养瓶致密度约为80~90%、活力达90%以上的环境下冻存。活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

　　④临床上肿瘤组织如何冻存？

　　不论是肿瘤组织还是正常组织或细胞，细胞冻存和复苏的关键都是“慢冻快融”。其实在组织冻存中使用的“玻璃化液”和细胞冻存中的“冻存液”作用是类似的，都是为了避免或减少冰晶的形成。

　　⑤细胞可以在液氮中保存多久？

　　理论上来说，细胞储存在液氮中的时间是不设限的。但为了妥善起见，很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞也最好每年复苏1次，再继续冻存。

　　其他注意事项

　　缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。

　　冻存密度：冻存时细胞密度不能太少，建议细胞浓度为1×106个活细胞/mL。

　　冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

　　冻存时长：细胞不能长期保存在-80℃冰箱中，建议保存时间不要超过48h（一般12h即可）。

　　冻存液：冻存液应于实验当天新鲜配制，常用冻存液配置比例为培养基：血清：DMSO=7：2：1或血清：DMSO=9：1，常规2mL冻存管以1mL冻存体积为佳。

　　降温速度：可使用程序降温盒或梯度降温，对于大多数细胞，-1℃/min的降温速度能最大程度地保存细胞活力。