养细胞的你必须知道的冷冻保存细胞的常识

　　冷冻保存细胞并创建自己的生物样本库是每个研究人员都需要经历的问题，无论是细胞株还是原代细胞，抑或是用于再生医学的间充质干细胞，冷冻保存可确保再生医学应用的高质量细胞随时可用。它允许标准化并减少对新鲜细胞分离的依赖。

　　冷冻细胞后我们总会在复苏的时候遇到各种各样的问题：

　　1.细胞活力降低：在冷冻过程中，细胞中的水会形成冰晶，冰晶会刺穿细胞膜并破坏内部结构，导致细胞死亡。冷冻过程中水分的去除会导致细胞内溶质浓度发生变化，从而产生渗透压，导致细胞收缩并破坏细胞成分。

　　2.冷冻保护剂的毒性：二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)或丙二醇(PG)等冷冻保护剂(CPA)是必不可少的，因为它们有助于减少冰晶形成并保护细胞膜。虽然CPA是必不可少的，但它们在高浓度下可能会产生细胞毒性。找到冷冻保护和细胞毒性之间的最佳平衡至关重要。

　　3.细胞特性丧失：比如在冻存间充质干细胞的时候，ECM为MSC保持其干细胞特性和分化潜能提供了重要线索。冷冻保存会破坏这些相互作用，从而可能影响间充质干细胞自我更新和分化为特殊细胞类型的能力。冷冻和解冻会改变表观遗传景观间充质干细胞是DNA上的化学修饰，可调节基因表达。这些变化会影响对干细胞和分化至关重要的基因的表达。

　　4.标准化问题：不同实验室的冷冻保存方案差异很大，冷冻/解冻速率、冷冻保护剂浓度和细胞培养条件各不相同。这种不一致可能导致每个实验室的细胞活力、细胞特性和整体功能性方面的结果各不相同。

　　怎么才能成功的冻存细胞：

　　一、准备阶段

　　将冻存管、离心管、移液管等耗材准备齐全，放入超净台中，打开紫外线照射30分钟进行消毒。同时，打开通风机通风3分钟，并用75%酒精擦拭操作台和双手，确保操作环境的无菌状态。此外，还需准备好冰盒，以及预热至37℃的完全培养基、DMSO、胰酶等试剂。

　　二、细胞选择与处理

　　1.选择处于对数生长期、致密度约为80-90%、活力达90%以上的细胞进行冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。

　　2.取出细胞，进行酒精消毒后放入超净台。按照细胞传代步骤，对细胞进行消化、解离。消化好的细胞离心后，弃掉上清液。

　　三、配置冻存液与重悬细胞

　　1.配置细胞冻存液，常用比例为无血清培养基：血清：DMSO=7：2：1，或含20%血清培养基、10%DMSO。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，可以用0.22微米滤膜过滤，或直接购买无菌产品。冻存液应提前配制，防止临时配制产生的热量损伤细胞。

　　2.用冻存液重悬细胞，用移液器轻柔吹打细胞，避免损伤细胞。同时，混匀DMSO要快，因为DMSO对细胞有毒性，混合后应尽快冻存。

　　四、细胞计数与分装

　　1.可用细胞计数板或计数仪器对细胞进行计数，将细胞总数调节至适宜范围，如1×10^6个/ml。

　　2.将细胞冻存悬液分装入细胞冻存管中，一般2ml冻存管装入1-1.5ml细胞冻存悬液为宜。然后密封冻存管，并标记好细胞名称、日期、细胞状态以及冻存者姓名等信息。

　　五、细胞冻存

　　1.按照-4℃30分钟、-20℃30分钟、-80℃过夜、液氮保存的顺序进行冻存。

　　2.细胞冻存是慢冻的过程，目的是使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶从而降低对细胞的伤害。对于大多数细胞来说，每分钟降1-3℃是标准的降温方法。

　　冻存细胞需要注意的问题：

　　1.DMSO本身就有灭菌的作用，因此使用前不需要进行高压灭菌。高压灭菌反而会破坏它的分子结构，降低冷冻保存效果。

　　2.在常温下，DMSO对人体有害，应注意生物安全防护。

　　3.冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。

　　4.细胞不可长期保存在-80℃冰箱中，建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48小时，然后尽快转移至液氮中长期保存。

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