多年细胞培养经验！摸清细胞培养门道其实很简单！

　　细胞是生物学实验的重要材料，也是生物细胞学实验的基础，药物、基因功能、疾病机理等的相关研究多数需要在细胞水平进行阐释。而细胞培养，受人员操作和环境条件的影响比较大，在细胞培养中常常会遇到很多的细节问题，而每个问题都有可能导致细胞培养的失败。

　　一、什么是细胞培养？

　　细胞培养：指将细胞从动物或植物体内取出，然后在适宜的人工环境中生长的过程。细胞可以在培养前直接从组织中取出并通过酶或机械方法进行解离，也可以来源于已建立的细胞系或细胞株。

　　原代培养：指细胞从组织中分离出来后，在适宜条件下增殖，直到它们占据所有可用的基质（即达到汇合状态）的培养阶段。在此阶段，必须通过将细胞转移到含有新鲜生长培养基的新容器中进行继代培养（即传代），以为其提供更多的继续生长空间。

　　细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。

　　细胞系：经过40-50次分裂的渡过第二次死亡危机的细胞，称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系已获无限繁殖能力的细胞系，称连续或无限细胞系。

　　二、无菌操作技术

　　细胞培养需在无菌环境下进行，那么要如何去做呢？

　　操作台无菌紫外照射30min左右，开风机吹3-5min再行操作，避免自身吸入臭氧。

　　带手套、口罩、白大褂等操作，75%的酒精擦拭手套，此处一定注意等手套上的酒精吹干以后再点燃酒精灯，不然分分钟休息一个月，安全真的很重要。

　　确保枪头是1个月内（最好2个周）高压灭菌处理过，超期重新灭菌，任何操作过程中，自我感觉（哪怕是错觉）枪头碰触了异物或自身就不干净（部分国产枪头，大家都懂得），不要犹豫，不要徘徊，立马换下一个。

　　取用培养基等液体，能不碰触瓶口，坚决不碰触瓶口。

　　物品左右怎样最方便自己取用就怎样提前放置，不交叉，不在敞口的器皿上动来动去，咱们要井水不犯河水的。

　　三、具体步骤

　　1、细胞复苏

　　将冻存细胞从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。将融化的细胞移入离心管中，加入37℃预热的DMEM完全培养基中（其中胎牛血清约为10%），轻轻吹匀，离心，500g离心2min，弃上清液。

　　加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，接种于培养皿/瓶中，在含5%CO₂的细胞培养箱中培养。

　　2、细胞传代

　　当细胞密度达到80%~90%（过早产量不足，过晚细胞状态不佳，1:2至1:10以上的比率传代培养，一般1:3至1:5细胞一代，即从细胞接种到分离再培养的一段时间，非细胞有丝分裂次数）时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。

　　加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度）进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。

　　加入适量DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。

　　加入DMEM完全培养基，轻轻吹打混匀，吸取10微升进行计数，然后按照所需细胞量在含5%CO₂的细胞培养箱继续培养。

　　不同细胞的贴壁能力不同，消化时间不同；不同细胞细胞间连接强度不一样，消化时间不同；同一细胞生长状状况不同，消化时间不同。消化时适时观察细胞形态，避免因过度消化影响细胞活性。

　　传代间隔时间和传代比例因细胞而异。细胞传代过程中，当细胞出现状态不好或者污染时及时弃去细胞，重新复苏。

　　不同细胞的贴壁能力不同，消化时间不同；不同细胞细胞间连接强度不一样，消化时间不同；同一细胞生长状状况不同，消化时间不同。消化时适时观察细胞形态，避免因过度消化影响细胞活性。

　　传代间隔时间和传代比例因细胞而异。细胞传代过程中，当细胞出现状态不好或者污染时及时弃去细胞，重新复苏。

　　3、细胞冻存

　　当细胞密度达到80%~90%时，去掉完全培养基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶进行消化，放入细胞培养箱中约2-3min。加入DMEM完全培养基终止胰蛋白酶消化，转移至离心管后500g离心2min，弃上清液，再加入DMEM完全培养基清洗，弃上清液。加入lml冻存液（90%胎牛血清，10%DMSO。

　　一般来讲血清含量可以在10%-90%之间调整，冻存液中加入血清一方面可以为细胞提供营养，另一方面可以在细胞冻存过程中提供非渗透性保护物质，如蔗糖，白蛋白等从而更好地保护细胞），放入冻存管内（管内有异丙醇，以保证温度降低的速度），立即放入4℃冰箱中冻存30min，然后放入-20℃冰箱中冻存30min，再置于-80℃冰箱内过夜。

　　第二天放入液氮中，可以保存至少两年，如不放入液氮，可以保存三个月。

　　细胞冻存和复苏的原则是：慢冻速融，这样更加有利于保持细胞的活力。冻存细胞不加任何保护剂，会导致细胞内冰晶的产生，从而使细胞产生内源性的机械损伤，引起细胞内环境渗透压，PH，电解质等的改变，进而促使细胞死亡。

　　四、注意要点

　　1、细胞培养应严格遵守无菌操作规范，所用一切试剂及耗材均为无菌。

　　2、细胞培养的关键点在于细胞培养的密度，传代时细胞密度不能过低，否则影响细胞间信号传递，最终会导致细胞状态不好；细胞培养到一定密度时，需要传代，一般贴壁细胞看细胞融合到80%就可传代，而培养悬浮细胞时，可通过看培养基颜色以及细胞密度来判断是否传代。

　　3、在培养传代过程中，需要用移液管吹打处理细胞，此时应尽量避免气泡的产生，否则产生的剪切力会对细胞有损伤，最终影响细胞状态（吹打过程中可以残留部分液体在移液管内，以减少气泡的产生）。

　　4、细胞洗涤离心的时候，离心力的选择一般是：原代细胞离心300-500g/5min，肿瘤细胞200-300g/5min。离心力过小收集到的细胞数量不够，离心力过大对细胞有损伤。

　　5、离心后的细胞沉淀弃去上清后，先弹散细胞沉淀，后加入培养基重悬铺板，这样比直接吹打细胞沉淀对细胞损伤小，提高传代后细胞活率。

　　6、细胞培养基应先在37℃温浴后使用，可以分装每次需要的量来温浴，避免反复温浴对培养基性能的影响（特别是含有蛋白或者细胞因子的培养基）。

　　俗话说，心诚则灵。对待细胞培养也应如此，“自己要用的细胞自己养”，多去观察细胞生长状态。