细胞生物学在生物工艺中的应用

　　1.介绍

　　哺乳动物的组织由许多不同类型的细胞构成，形成各种器官。它们都源自同一个受精卵，然后分化成具有截然不同特性的细胞，使用相同的遗传信息，却走向非常不同的命运。一个多世纪前，科学家们开始从外植组织中分离细胞。在第1章中，我们简要讨论了使细胞培养成为研究工具和生产宿主的促进性进展，包括培养基的开发及其膜灭菌和细胞胰蛋白酶化和传代。大多数从组织中生长出来的细胞只能被培养几代，但最终有一些细胞成功建立，可以传代许多代。在冷冻保存方法建立后，细胞可以被“储存”以备将来使用，这允许产生对研究和生产至关重要的可复制结果。在细胞培养的早期几十年中建立的大多数细胞都是从肿瘤中衍生的。这些细胞在形态上与从正常组织中生长出来的原代细胞不同。即使是那些最初从正常组织中分离出来并且可以连续传代的细胞，看起来也更像来自肿瘤的细胞。随着对生长因子和细胞外基质的认识的增加，从20世纪70年代开始培养正常和分化的细胞。成体干细胞的分离以及随后小鼠胚胎多能干细胞的分离，与更多生长因子和细胞因子的广泛可用性，开始改变细胞培养的研究格局。20世纪90年代大量生产治疗蛋白的需求改变了我们对细胞的看法。它们现在是生物制造的主要工作马。本章将讨论影响细胞生长和细胞生产蛋白产品能力的细胞结构组成部分的关键方面。

　　2.组织细胞及其分离

　　2.1.细胞系、细胞株和衰老

　　从哺乳动物组织中分离出的绝大多数细胞都是锚定依赖性的，这意味着它们需要表面粘附才能增殖。它们通常通过组织（图2.1）的酶解离来分离。解离后去除未解离的块状物，将细胞种植在与培养基覆盖的兼容表面上。培养基悬浮液中的细胞团附着在表面，并逐渐有一些细胞从组织团中生长出来。随后，细胞延伸其体长，展开，并开始增殖。当它们开始覆盖整个表面积时，生长速率减慢，最终在表面上形成一层“单层”细胞。达到融合后，细胞分裂停止。虽然相邻细胞的细胞体可能会相互交叉，但它们的细胞核永远不会重叠。这被称为细胞生长的接触抑制。接触抑制的细胞可以通过胰蛋白酶处理从表面解离。在更大的表面上重新种植并提供新鲜培养基后，细胞生长恢复，直到再次达到融合。这个过程可以重复以扩大种群。每次解离和扩展称为“传代”。每个传代中发生的细胞倍增数量由分裂比决定，或每次传代中扩展的表面积比（见参考文献1以供进一步阅读）。

　　直接从组织中分离的细胞称为原代细胞（面板2.1）。大多数原代细胞在非常少量的细胞倍增后停止生长。这对于从特殊组织中分离的细胞尤其如此，如肝脏和卵巢。它们通常很快在培养中失去其典型的组织相关特性。体内大多数组织中的细胞是静止的，这意味着它们不分裂（面板2.2）。静止状态不仅仅是由于缺乏生长所需条件的被动结果，例如缺少必需的营养物质。相反，静止状态是由生物体的调节强加于细胞的。例如，我们体内的干细胞大部分时间处于静止状态，这是通过细胞周期调节，通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、转录因子和肿瘤抑制因子。从组织外植中生长出来的细胞已经经历了细胞生长控制机制的变化，使其能够在培养中增殖。

　　在某些情况下，从分离的组织中生长出来的细胞可以连续传代并在许多传代中仍然保持正常的形态和细胞行为。它们甚至可以在液氮中冷冻保存，并被“储存”以备将来的研究、分发或生产目的。然而，这种反复的传代和细胞培养中的扩展不能无限期地继续。最终，会达到衰老。在衰老之前，这些细胞在形态上是正常的。它们的核型是二倍体，即具有两套正常染色体。几乎所有来自哺乳动物组织的正常的二倍体细胞在培养中的寿命都是有限的，胚胎干细胞和诱导多能干细胞除外。与组织细胞相比，癌细胞在体内增殖。它们通常携带多种突变，使它们能够绕过通常会保持它们处于静止状态的生长控制机制。因此，它们更容易从肿瘤组织中分离出来进行体外培养。有时，也可以通过病毒或癌基因转化的“永生化”从正常组织中建立细胞系。那些可以无衰老地连续生长的细胞通常与它们的正常对应物没有相同的形态。它们的核型不是二倍体，它们的增长不受接触抑制。在充足的营养物质和生长因子供应下，它们甚至可以相互叠加形成多层细胞。这样的细胞包括常用的工业细胞系，如来自中国仓鼠卵巢的CHO细胞，来自绿猴肾的Vero细胞，以及人类肾脏细胞HEK293。

　　在没有使用特殊培养条件来丰富分化细胞的情况下，成纤维细胞是从正常哺乳动物组织中分离出的主要细胞类型。从小鼠胚胎中分离出的成纤维细胞可以在体外培养大约60次倍增。随着这一极限的临近，细胞开始未能达到融合，并最终停止生长。这种衰老，或者说这些细胞增殖潜力的限制，被称为“海夫利克现象”。这是所有正常二倍体细胞（再次，胚胎干细胞和诱导多能干细胞除外）的共同现象，它们来自脊椎动物。

　　在半个世纪前进行的一项历史性实验中，将小鼠成纤维细胞持续传代超越危机，产生了一小部分幸存者。这些细胞最终生长、扩展，并且可以在体外无限制地连续培养。它们被命名为3T3，因为细胞每三天传代一次，每次在20平方厘米的培养皿中扩展3×10^5个细胞。这些细胞看起来正常，并在典型的培养条件下受到接触抑制。然而，与危机前的鼠成纤维细胞不同，3T3细胞具有异常的非二倍体染色体组。那些屈服于海夫利克限制的细胞（例如，那些是二倍体并且有有限寿命的细胞）被称为“细胞株”。可以在培养中无限生长的细胞被称为“细胞系”，包括那些在危机过后重新建立的，直接来自正常或肿瘤组织。一般来说，细胞系是非整倍体的（没有正常的染色体组）。

　　因此，受衰老影响的细胞似乎“计数”它们的倍增次数。衰老是由细胞事件调节的，通常被认为与衰老有关。它本质上是一种生长停滞，但与静止状态不同。处于静止状态的细胞可以恢复到它们的生长阶段，但进入衰老的细胞经历了不可逆的生长停滞。衰老也可能因应激或癌基因过表达而发生，或由端粒缩短引起。端粒是染色体末端的特殊重复序列。它们在DNA复制过程中不被DNA聚合酶复制，而是由端粒酶合成。DNA聚合酶反应不能准确复制端粒的串联重复次数。因此，细胞间的端粒长度有很大差异。随着传代次数的增加，端粒会变得更短，除非它们被端粒酶修复。例如，在胚胎干细胞中，端粒酶活性很高，以维持端粒长度。与细胞株不同，胚胎干细胞不表现出衰老。

　　2.2.干细胞和分化细胞

　　从正常或癌变的分化组织中分离出的细胞通常根据化学和物理环境的不同程度保留它们的分化特性。许多从癌症组织中分离出的分化细胞，包括HepG2细胞（来自肝细胞癌）、Jurkat细胞（来自白血病的人类T淋巴细胞）和PC12（从大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤中分离出的神经细胞，在培养中可以诱导形成树突，几十年来对生物医学研究非常有价值。它们都是连续的细胞系。尽管它们保留了一些它们衍生的组织的分化表型，但许多重要的组织特性都丢失了。过去三十年来，细胞表征和生长因子的研究工具的进步，使得从正常组织中培养各种分化细胞成为可能，包括内皮细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、单核细胞和平滑肌细胞。这些原代组织细胞保留了许多组织特异性活性，不仅在研究中很有价值，而且可能对组织修复或再生有价值。然而，正如本章后面将讨论的，体内大多数分化细胞处于G0阶段的细胞培养中，并且不增殖。从这些组织中分离出的细胞具有非常有限的增殖潜力，并在培养中表现出表型不稳定性。对于可能的再生医学应用，从组织中分离出的分化细胞不是可持续的细胞来源。

　　干细胞必须能够自我更新（即，能够制造更多的自己）并分化为目标细胞。它们存在于许多成人组织中，并在它们的生态位中处于静止状态，只有在需要时才扩展和分化。一些成人干细胞已经被分离并在培养中生长了几十年，包括从骨髓中分离出的造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC）。它们的增殖潜力有限，在培养几代后，它们失去了更新和分化能力。这些成人干细胞是多能的，意味着它们可以分化成多种但数量有限的细胞系。即使增殖潜力不到无限，成人干细胞也有能力产生大量分化细胞（如来自MSC的骨细胞和肌肉细胞）用于异体应用。

　　与成人干细胞相比，在胚胎发育的非常早期阶段分离出的胚胎干细胞在体外具有几乎无限的自我更新能力，并且是多能的，意味着它们可以分化成所有成人组织类型的细胞。它们不会经历衰老，在再生应用中具有巨大的潜力。然而，由于它们来自受精的人类卵子，它们的使用在伦理上是有争议的。为了缓解这些伦理担忧，设计了一种过程，将成人体细胞重新编程为未分化的胚胎状态。这些诱导的多能干细胞（iPSC）可以通过引入四个外源基因（OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc（OSKM））对成人组织细胞如成纤维细胞进行表观遗传重新编程来获得。iPSCs具有与胚胎干细胞相似的分化成不同细胞系的潜力。胚胎干细胞和iPSC都可以被引导分化成各种类型的细胞，包括造血干细胞、肝细胞（肝细胞）和胰岛细胞，方法是使用一系列生长因子的鸡尾酒来模拟体内分化条件。

　　2.3.生物制剂制造的细胞

　　通常用于生产生物制剂的细胞来自不同物种的不同组织。从不同物种中分离出的细胞在染色体数量和基因组序列上有所不同。然而，在生理和转录组水平上，来自不同物种相同组织的细胞非常相似。它们的相似性比来自同一物种的不同细胞类型要大得多。例如，鸡胚成纤维细胞在形态上非常类似于来自肺部或包皮的人类成纤维细胞，而上皮MDCK细胞看起来与狗成纤维细胞非常不同，尽管它们都来自同一物种。

　　NS0和CHO是用于治疗性重组蛋白生产的两个突出的宿主细胞系。它们表现出不同的行为，并且源自两种不同的组织和两种不同的物种。CHO细胞是从中国仓鼠的卵巢中分离出来的，而NS0细胞来自小鼠的骨髓瘤。用于重组蛋白生产的细胞主要是上皮细胞和淋巴细胞。成纤维细胞和上皮细胞也常用于病毒疫苗的生产。重组蛋白生产与疫苗生产对细胞系的选择基于根本不同的需求。前者要求易于遗传操作和分泌大量蛋白，而后者需要与病毒的嗜性相匹配的细胞以及最小的抗病毒反应。

　　上皮细胞排列在组织的“边界”，而成纤维细胞构成了更大的结缔组织部分。上皮细胞形成紧密连接的片层，这些片层经常受损、死亡并由“新”细胞补充。成纤维细胞大多处于静止状态。它们迁移到伤口中，并在受到各种信号刺激时才开始生长。骨髓瘤细胞衍生的终末分化的浆细胞分泌针对特定抗原的抗体。这些抗体只在宿主暴露于抗原后的有限时间内需要。这些细胞在分化为活跃的抗体分泌细胞后的两到三周内会经历凋亡，以便宿主不会继续在循环中拥有大量不需要的抗体分子。许多原始组织细胞的原生特征通常在组织来源的细胞系中仍然明显。

　　3.细胞膜

　　关于在生物反应器中培养哺乳动物细胞的一个过时但之前普遍持有的信念是，细胞极其脆弱，容易受到机械应力的影响，因为唯一阻止细胞内容物溶解到水环境中的是脂质双层膜。然而，在现代制造工厂中，细胞在数十立方米体积的生物反应器中，在高度湍流的条件下茁壮成长。包围细胞的质膜不仅仅是一个简单的脂质双层，细胞的完整性不仅仅由其膜包装决定。

　　3.1.脂质双层

　　构成脂质双层的脂质是两性磷脂。每个磷脂分子由一个甘油骨架连接一个包含带电磷酸基团的亲水头基和一个由两个脂肪酸组成的疏水尾基（图2.3）。疏水尾中的脂肪酸提供了在温和温度下形成有序膜结构所需的疏水相互作用。当悬浮在水溶液中时，两性分子可以形成胶束。在这样的胶束中，亲水头向外，疏水尾向内。胶束的组织使得它很容易在内部包裹疏水分子，而内外都没有水环境。相比之下，由脂质双层膜形成的球体则疏水尾向双层中间投影，亲水头在外部和内部表面。它可以很容易地在内外都有水环境。

　　.细胞质和细胞器

　　细胞质和细胞核都被细胞的细胞质膜包围。细胞质大致可分为两组：细胞器和高粘度的细胞溶胶。细胞溶胶含有非常高浓度的蛋白质（100-300毫克/毫升）。相比之下，血浆中的蛋白质含量仅为90毫克/毫升。细胞溶胶还含有无机溶质、构建块以及代谢反应的中间体和代谢物。

　　细胞溶胶不仅充满了可溶性组分（面板2.10）。它还包含大型颗粒（或聚集体）。核糖体是制造蛋白质的主要机械；它是一个由许多核糖蛋白和核糖核酸（rRNA）组成的复杂颗粒。每个细胞包含数千个约30纳米大小的核糖体。许多核糖体位于内质网的细胞溶胶表面，在电子显微镜下观察时呈现为黑点。一些酶也形成大型复合物，可以在电子显微镜下看到，如丙酮酸脱氢酶复合物。