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上海碧云天生物技术股份有限公司
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细胞凋亡检测方法
人阅读 发布时间：2022-02-28 14:57
细胞凋亡是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡方式，是一种最典型的细胞程序性死亡 (Programmed Cell Death)，普遍存在于生物体发育等生命过程中。当机体遇到内、外环境因子刺激时，会自我启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。在这一过程中，细胞会裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，不会导致炎症反应。
细胞凋亡大致可以分为三个阶段，包括凋亡早期、凋亡中期和凋亡晚期。每个阶段都具有各自的细胞形态学变化和分子特点。
凋亡早期：细胞膜通透性改变；磷脂酰丝氨酸外翻；起始 Caspase 激活；线粒体膜电位改变
凋亡中期：效应 Caspase 被激活，细胞内特定蛋白被 Caspase 切割
凋亡晚期：DNA 断裂；凋亡小体形成；凋亡小体被吞噬细胞吞噬
细胞凋亡大致可以分为三个阶段，包括凋亡早期、凋亡中期和凋亡晚期。每个阶段都具有各自的细胞形态学变化和分子特点。
凋亡早期：细胞膜通透性改变；磷脂酰丝氨酸外翻；起始 Caspase 激活；线粒体膜电位改变
凋亡中期：效应 Caspase 被激活，细胞内特定蛋白被 Caspase 切割
凋亡晚期：DNA 断裂；凋亡小体形成；凋亡小体被吞噬细胞吞噬
在上述过程中，同时还伴随着细胞形态学变化，包括细胞体积缩小，细胞间连接消失，细胞膜通透性改变。随后会出现细胞质密度增加、细胞核出现核质浓缩、核膜核仁破碎的现象。
根据细胞凋亡不同时期的特点，细胞凋亡的检测方法也有许多种
形态学及细胞膜通透性检测
细胞凋亡的不同时期，细胞在形态上会发生明显的变化。利用透射电镜可以清楚地观察到细胞内部结构在凋亡过程中的变化，但是由于电镜价格相对昂贵，且拍摄时样品处理过程复杂，对使用者技术水平要求较高，因此并不是实验室常用的细胞凋亡形态学检测手段。
DAPI、Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 等荧光染料能够与 DNA 结合，结合后会呈现明亮的蓝色荧光，用荧光显微镜观察可以清楚看到细胞核的形态变化，常用于细胞凋亡检测。
根据细胞凋亡不同时期的特点，细胞凋亡的检测方法也有许多种
形态学及细胞膜通透性检测
细胞凋亡的不同时期，细胞在形态上会发生明显的变化。利用透射电镜可以清楚地观察到细胞内部结构在凋亡过程中的变化，但是由于电镜价格相对昂贵，且拍摄时样品处理过程复杂，对使用者技术水平要求较高，因此并不是实验室常用的细胞凋亡形态学检测手段。
DAPI、Hoechst 33342 和 Hoechst 33258 等荧光染料能够与 DNA 结合，结合后会呈现明亮的蓝色荧光，用荧光显微镜观察可以清楚看到细胞核的形态变化，常用于细胞凋亡检测。
图 1. 正常培养的 HeLa 细胞用 Hoechst 33342 活细胞染色液 (100X) 染色后的实拍效果图。图 A 为正常细胞 Hoehst 33342 的染色效果图。图 B 中除了正常细胞外，还清晰可见呈现致密浓染的凋亡细胞。
吉姆萨染色法则可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、细胞核碎裂、凋亡小体形成等过程。
YO-PRO-1，又名恶唑黄 (Oxazole yellow)，简称 YP1，也是一种对正常动物细胞膜没有通透性而对于凋亡细胞的细胞膜有通透性的 DNA 绿色荧光染料，常用于细胞凋亡的检测。
YO-PRO-1 在没有与 DNA 结合的时候基本上没有荧光，而与 DNA 结合后可以发出明亮的绿色荧光。可与 PI 荧光双染用于细胞凋亡的检测。
图 2.YO-PRO-1/PI 细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测 MOLM13 (人急性髓原白血病细胞) 细胞凋亡与坏死的效果。
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磷脂酰丝氨酸外翻
正常情况下，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会出现磷脂酰丝氨酸外翻的现象。Annexin V 是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内的 Ca2+依赖型磷脂结合蛋白，参与细胞内的信号转导，能与 PS 特异性结合，且具有较高亲和力。用特定荧光探针标记 Annexin V，就可以利用流式细胞仪或荧光显微镜简单直接地检测 PS 外翻这一细胞凋亡重要特征。
常用的荧光探针主要有 PE、FITC、EGFP 和 mCherry 等。与藻红蛋白 (Phycoerythrin, 简称 PE) 相比，mCherry 标记的 Annexin V，激发光谱更窄，不会像 PE 那样在 495nm 左右产生红色荧光，非常适合与其它绿色荧光一同检测，在进行流式检测时几乎不需要进行任何补偿。
图 2. Annexin V-mCherry 细胞凋亡检测试剂盒检测 Jurkat (人 T 淋巴细胞瘤细胞) 细胞凋亡的效果
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线粒体跨膜电位改变
细胞发生凋亡时，线粒体通透性转换孔的开放显著改变了线粒体通透性。持续的线粒体通透性转换孔开放，导致 Ca2+过载、线粒体氧化型谷胱甘肽、线粒体中活性氧水平升高，最终导致细胞色素 C 的释放及线粒体膜电位降低和消失。
我们可以利用特定的阳离子荧光染料对线粒体膜电位变化进行测定。正常情况下，线粒体内部存在大量的负电荷，阳离子荧光染料会在线粒体基质中积聚，当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位丢失，线粒体通透性转换孔持续开发，荧光染料被释放到细胞质中，线粒体内荧光强度明显下降。可以利用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等设备通过荧光信号的强弱来判断线粒体膜电位变化和细胞凋亡情况。
常用阳离子荧光探针有：
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Caspase 活性检测
Caspase 英文全称是 cysteine-dependent aspartate-specifc proteases，中文名称为胱天蛋白酶或半胱天冬酶，是一组存在于胞质溶胶中的半胱氨酸蛋白酶。能够特异性切割含有天冬氨酸（Asp）的多肽底物，选择性地对多种信号转导途径中的蛋白质进行高效切割，在介导细胞凋亡过程中起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。
根据其蛋白酶序列的同源性可分为 3 大类：
起始 Caspases：包括 Caspase-2，8，9，10，11，负责对效应者的前体进行切割；
效应 Caspases：包括 Caspase-3，6，7，负责切割细胞核及细胞质中的结构蛋白和调节蛋白，保证凋亡程序正常进行；
促炎性 Caspases：包括 Caspase-1，4，5，11，12，13。
其中 Caspase-3 是哺乳动物细胞中研究最多的 Caspase 酶之一。Caspase-3 是细胞凋亡过程中的关键酶，可以直接特异性剪切多种 caspase 底物，包括 PARP、ICAD、proCaspase-6、7 和 9、gelsolin 和 fodrin 等。这些由 Caspase-3 介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。同时 Caspase-3 还参与细胞核凋亡过程，如染色质固缩，DNA 片段化等。另外，Caspase-3 对凋亡过程中的细胞起泡也起到了关键作用。
选用适当的底物，就可以实时监测活细胞中 Caspas-3 活性。碧云天选用的 GreenNuc™ Caspase-3 底物为耦合 DNA 绿色荧光染料的多肽 DEVD，该底物中的 DEVD 是 caspase 3/7 的识别序列，并带有大量负电荷。在凋亡细胞中被 Caspase-3/7 识别并剪切，释放出活化的 DNA 绿色荧光染料分子。活化的 DNA 绿色荧光染料分子迁移进入细胞核，与 DNA 结合后，形成 GreenNuc™-DNA 复合物，就可以被激发而产生明亮的绿色荧光。
图 3. GreenNuc™活细胞 Caspase-3 活性检测试剂盒的检测原理图。
此外也可以利用 Western Blot 实验检测细胞凋亡过程中相关蛋白表达水平的变化。
DNA 断裂
细胞发生凋亡时，细胞内特异性核酸内切酶活化，染色质 DNA 在核小体间被特异性切割，DNA 降解成 180--200bp 或其整数倍片段，因此凋亡细胞中提取的 DNA 在进行常规的琼脂糖凝胶电泳时，这些大小不同的 DNA 片段就呈现出梯形条带（DNA ladders），这一方法是鉴定细胞凋亡最为简单可靠的方法之一。
同时，基因组 DNA 断裂时，暴露的 3'-OH 可以在末端脱氧核苷酸转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT) 的催化下加上特定荧光探针荧光素标记的 dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
图 4. 碧云天一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒 (绿色荧光) 的检测效果与国外同类产品检测效果的比较。
碘化丙啶是一种双链的 DNA 荧光染料，与双链 DNA 结合后可以产生荧光，并且荧光强度与双链 DNA 含量成正比。细胞发生凋亡时出现的细胞核浓缩及 DNA 片段会会导致部分基因组 DNA 片段丢失，所以当用碘化丙啶对细胞进行染色并用流式细胞仪分析时荧光强度有所降低，从而出现明显的 sub-G1 峰，即凋亡细胞峰。并且，在细胞发生凋亡时，由于胞浆和染色质浓缩、核碎裂，细胞的光散射性质会发生变化，通过检测前向散射和侧向散射的变化也可以观察细胞的凋亡情况。
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