在实验中大家经常遇到这些问题：

1.通过各种在线软件进行预测获得miRNA靶向基因，但miRNA对靶基因的实际作用不清楚;

2.又或者预测到转录因子对基因的表达起抑制或增强的作用，而具体活性以及结合位点仍然需验证;

3.lncRNA或者circRNA吸附miRNA效果如何还未知。

这个时候就需要用到荧光素酶(Luciferase)实验。

荧光素(Luciferase)是自然界中能够产生生物发光的酶的统称，其中最有代表性的是来自萤火虫体内(Firefly)和海肾(Renilla)体内的两类萤光素酶，分别命名为F-Luciferase和R-Luciferase。

荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光(bioluminescence)，可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于启动子转录活性调控及miRNA靶基因验证等方向研究。荧光素酶的具体应用，主要有以下两个方面：

 

荧光素酶的应用

(一)：pGL3-Basic---用于转录因子结合位点与启动子活性分析。

把待分析启动子区段构建到F-Luciferase上游，和转录因子共转染分析F-Luciferase活性即可反应启动子的活性高低。该质粒通常需要结合持续性表达R-Luciferase的载体作为内参以校正不同样品之间转染的转染效率。

 

启动子的作用相当于“基因开关”，能够控制基因表达的起始和表达。而启动子的活性受转录因子的调节，转录因子是一种具有调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。一些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因分析(luciferase assay)是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。

 

将靶启动子的特定片段插入到报告基因质粒中荧光素酶编码序列的5’端，再与转录因子表达质粒共转染细胞，加入特定的荧光素酶底物，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。结合定点突变等方法则可进一步确定转录因子与靶标启动子的作用

 

(二)：psiCHECK2---miRNA与其靶点相关分析,包括miRNA靶基因验证、lncRNA与circRNA吸附miRNA验证等。

需要把miRNA潜在结合靶点克隆到R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域，然后与待测miRNA共同转染细胞内测定R-Luciferase活性高低，F-Luciferase (hLuc+)作为校正内参校正不同样品之间转染的转染效率。

 

miRNA通常功能性作用于靶基因3’UTR，因此可以将目的基因mRNA3’UTR序列插入载体R-Luciferase (hRLuc) 3’UTR区域， 通过比较miRNA引起的R-Luciferase活性高低来定量检测miRNA对目的基因的抑制作用;结合定点突变等方法则可进一步确定miRNA对靶基因3’UTR的直接靶向序列。

 

荧光素酶已成为科研中运用最广泛的报告基因之一，其具有检测灵敏度高、结果重复性好、信噪比较高和易于检测等特点。

逐典萤光素酶报告基因检测试剂盒

逐典萤光素酶报告基因检测试剂盒旨在准确、灵敏、高效地测定萤火虫萤光素酶活性，应用高通量药物筛选、药物活性检测、大规模启动子功能测定、信号通路等研究。

目前，最常使用的萤光素酶主要包括 Firefly luciferase 和 Renilla luciferase，针对报告基因检测不同的侧重需求，逐典推出了3种检测系统。