小动物跑步机 | β-半乳糖苷酶靶向前药减轻老年小鼠的炎症并恢复其身体功能

为了设计一种溶酶体β-半乳糖苷酶响应的前药，作者首先筛选了一系列FDA批准的药物，最终选择吉西他滨，一种对衰老细胞具有强大细胞毒性的化合物作为最终产物。因为它有效地且强有力地杀死了小鼠和人类的衰老细胞（图1a）；它的4-氨基基团是前药开发中一个已经确立的位点；由于其血浆循环时间短，它显示出降低的系统毒性。并合成衰老特异性杀伤化合物1（SSK1）（图1b）。作者还验证了前药SSK1在衰老细胞中被特异性切割以释放细胞毒性的吉西他滨而不是非衰老细胞中（图1c）。这些结果表明SSK1对衰老细胞有毒，对非衰老细胞无毒。

为了测试SSK1选择性杀死衰老细胞的能力，作者用SSK1处理了小鼠原代成纤维细胞及其复制诱导的衰老对应物。结果发现SSK1选择性地且强有力地消除了β-半乳糖苷酶阳性的衰老细胞（图1d），降低编码β-半乳糖苷酶的基因GLB1的表达，损害了SSK1杀死阳性衰老细胞的能力（图1e），表明其对衰老细胞的特异性取决于溶酶体β-半乳糖苷酶活性。总的来说，作者利用溶酶体β-半乳糖苷酶，这一衰老细胞的共同特征，设计了一种前药，专门杀死衰老细胞。

接下来，作者探索了SSK1在衰老细胞中的分子机制。发现SSK1可以在衰老细胞中被处理成吉西他滨并激活p38 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。因此，SSK1通过激活p38 MAPK信号通路杀死衰老细胞。此外，SSK1能够激活caspase 3，这表明SSK1通过诱导凋亡杀死衰老细胞（图1g）。这些结果表明，前药SSK1被溶酶体β-半乳糖苷酶激活，并通过激活p38 MAPK和诱导凋亡选择性地杀死衰老细胞。

接着作者测试了SSK1对小鼠和人类衰老细胞的特异性。首先，作者用SSK1处理了由电离辐射、致癌基因（KrasG12V）过表达或基因毒性应激（依托泊苷处理）诱导的衰老的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。这些由不同刺激诱导的衰老细胞被SSK1选择性杀死，而非衰老细胞大多未受影响（图2a）。其次，作者发现与非衰老对应细胞相比，SSK1能选择性地杀死成年小鼠复制诱导的衰老肺成纤维细胞（图2b）。为了了解SSK1在不同物种间的效能差异，作者用SSK1处理了由不同刺激诱导的衰老的人类胚胎成纤维细胞（HEFs）。结果表明，SSK1选择性清除了由不同应激诱导的人类衰老细胞，且呈剂量依赖性，对非衰老细胞没有明显影响（图2c）。作者还用SSK1处理人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）和人类前脂肪细胞，发现与非衰老细胞相比，衰老细胞被SSK1选择性杀死（图2d）。总的来说，结果表明SSK1选择性地杀死了小鼠和人类的衰老细胞，且与细胞类型和衰老刺激无关。

接下来，作者检验了SSK1对体内衰老细胞的影响。采用两种独立的体内衰老模型：应激诱导的衰老和自然发生的衰老。通过腹腔注射给这些肺部受损的小鼠注射载体或SSK1（图3a），发现与载体处理的肺部受损小鼠相比，SSK1显著减少了肺部SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例，SSK1处理组的肺组织中衰老相关基因的表达显著降低（图3b-e）。以上结果表明SSK1能够消除SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞，并减少体内的衰老相关标记物，为缓解衰老相关的肺损伤提供一种潜在的方法。

为了进一步检验SSK1对老年小鼠中自然发生的衰老细胞的影响，作者对20个月大的C57BL/6小鼠间歇性地用SSK1、吉西他滨或载体处理8周（图4a）。结果发现与载体和吉西他滨相比，SSK1减少了老年小鼠肝脏、肾脏和肺组织中的SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞，降低了老年小鼠中其他衰老标记物的表达（图4b- g）。这些结果表明SSK1减少了自然积累的衰老细胞，并降低了小鼠中的衰老标记物。

衰老细胞分泌一系列炎症细胞因子、趋化因子、蛋白酶和其他因素，统称为SASP。SASP有助于衰老期间局部和全身低度炎症，与年龄相关的退行性表型，以及身体功能的损害。作者发现SSK1减轻了老年肝脏和肾脏中与SASP相关基因的表达模式，下调了与炎症反应、TNFα/NF-κB信号通路、IL6/JAK/STAT3信号轴和补体系统相关的基因，趋向于年轻对应水平,降低了老年肝脏和肾脏中的年龄相关标志（图5a-j）。结果表明，SSK1清除衰老细胞有助于缓解老年小鼠中的年龄相关标志。

由于SSK1减少了局部和全身的慢性炎症，作者进一步测试了SSK1处理的老年小鼠的功能改善。通过一系列功能测试评估它们的身体表现，这些小鼠功能测试的结果表明，运动功能、平衡能力、运动耐力、骨骼肌容量和自发探索能力得到了改善（图6a-e）。总的来说， SSK1在改善老年小鼠的身体功能方面更有效。