防胜于治：菌种保藏中那些必须死守的污染防线

       菌种，作为生命科学研究和生物产业发展的核心资源与“芯片”，其纯正性与活性是实验可重复性、生产稳定性和数据可靠性的基石。然而，在菌种保藏的各个环节——从制备、分装到存储与复苏——污染风险无处不在。一次意外的污染可能导致珍贵菌株丢失、实验失败、生产事故甚至生物安全风险。对于像北京百欧博伟生物有限公司这样专业的生物技术企业，建立并严格执行规范的防污染措施，是保障产品质量与客户信任的关键。

菌种保藏污染的主要来源与风险

1. 环境微生物： 空气中的细菌、霉菌孢子，工作台面、设备表面的残留微生物。

2. 人员操作： 操作者皮肤、呼吸道、衣物携带的微生物，不当的操作手法（如说话、咳嗽、未规范穿戴防护用品）。

3. 交叉污染： 不同菌种间因共用器具、空间或操作失误导致的相互混杂。

4. 培养基与试剂： 灭菌不彻底的培养基、水、缓冲液或其他添加试剂。

5. 保藏容器： 冻存管、安瓿瓶、菌种管等容器本身灭菌不彻底或密封不严。

6. 保藏设备： 冰箱、超低温冰箱、液氮罐内壁或架子的污染，温度波动导致冷凝水形成滋生微生物。

菌种保藏全流程防污染关键措施

一、环境控制：打造“无菌堡垒”

1. 专用洁净空间： 在洁净度符合要求的实验室（如万级或局部百级洁净区）内进行菌种操作，特别是分装、转移等关键步骤。超净工作台/生物安全柜是必备屏障！ 使用前务必开启紫外线灯照射足够时间（通常30分钟），并用75%酒精擦拭台面。操作时打开风机和照明灯。

2. 空气与表面消毒： 定期对实验室环境进行紫外灯照射和/或熏蒸消毒。每次实验前后，用合适的消毒剂（如75%酒精、含氯消毒剂）彻底清洁工作台面、设备表面及门把手等高频接触点。

3. 控制人员流动： 尽量减少操作期间人员进出，避免不必要的走动和交谈，防止气流扰动带入污染。

二、人员操作：规范是防污染的生命线

1. 严格个人防护： 进入操作区必须穿戴洁净的实验服、一次性口罩、帽子和手套。长发需束起。操作前用75%酒精消毒手套。

2. 无菌操作技术：

   • 火焰灭菌： 接种环、镊子、剪刀等金属器具使用前后必须在酒精灯或本生灯外焰充分灼烧灭菌，冷却后再接触菌种或培养基。试管口、瓶口在开启前后也需快速过火。

   • 移液防污染： 使用带滤芯的移液器吸头，避免气溶胶污染移液器内部和样本。吸取不同菌种或试剂务必更换吸头。禁止用嘴吸液。

   • 开盖与封口： 打开培养皿、试管盖时，盖子应朝下拿在手中，避免上方空气落入。操作完毕立即盖紧。

   • 动作轻柔迅速： 减少器皿在开放环境中的暴露时间。动作要稳、准、快，避免产生大的气流或液体飞溅。

3. 避免交叉污染： 明确区分不同菌种的操作区域和器具。一种菌种操作完毕后，彻底清理台面、更换手套，再进行下一种操作。对高价值或危险菌种，建议单独空间操作。

三、材料与器具：源头把关，灭菌彻底

1. 培养基与试剂： 严格按照规程进行高压蒸汽灭菌（121°C, 15-30分钟）或过滤除菌（0.22μm滤膜）。验证灭菌效果（如使用灭菌指示带/条）。现配现用或妥善保存。

2. 保藏容器： 冻存管、安瓿瓶等必须选择质量可靠、密封性好的产品。使用前需经过严格清洗和高压蒸汽灭菌或干热灭菌（如适用）。灭菌后烘干，避免内部残留水分。

3. 实验器具： 玻璃器皿、塑料耗材（如培养皿、离心管）均需彻底灭菌。一次性耗材应确保无菌包装完好并在有效期内使用。

四、保藏过程：细节决定成败

1. 分装与标记：

   • 在超净台内进行分装。

   • 每个保藏容器（如冻存管）只装一种菌株，且不宜过满（尤其液体冷冻保藏时，预留膨胀空间，通常不超过容器体积的2/3）。

   • 即时、清晰、牢固地标记！ 使用防水、耐低温（如液氮气相）的记号笔或标签。标注内容至少包括：菌株编号/名称、保藏日期、操作者姓名/缩写。建议使用双重标记（管身和管盖）。标记错误或不清是重大污染和混淆隐患！

2. 密封性检查： 旋紧冻存管盖（确保O型圈完好），安瓿瓶熔封需均匀严密。使用前可进行密封性抽检（如浸水测试）。

3. 冻存保护剂： 使用无菌的甘油、DMSO等冻存保护剂，并确保其浓度适当、与菌悬液混合均匀。

4. 冷冻过程： 采用程序性降温（使用程序降温仪）或逐步降温法（如先4°C 1-2小时，再-20°C 1-2小时，最后入-80°C或液氮），避免冰晶过大损伤细胞，同时减少因温度骤变导致容器破裂或密封失效的风险。避免反复冻融。

五、存储管理：稳定环境，严格监控

1. 专用设备： 使用专用、运行稳定的冰箱（4°C）、超低温冰箱（-80°C）或液氮罐（气相或液相）进行保藏。避免与非菌种物品（尤其是未灭菌物品）混放。

2. 温度监控与报警： 安装24小时温度监控记录仪，并设置报警系统（短信、电话通知）。定期检查设备运行状态和记录。

3. 定期整理与盘点： 建立详细的菌种库存电子和纸质档案（位置、名称、日期、数量、状态）。定期盘点，检查容器密封性、标签清晰度、液氮液位（如适用）。

4. 备份与异地保存： 对核心或珍贵菌株进行多重备份，并考虑在不同地点或专业菌种保藏中心进行异地保藏，以防范设备故障、自然灾害等风险。

六、复苏与验证：最后的防线

1. 复苏操作： 在超净台内操作。从低温环境取出的冻存管应快速复苏（如放入37°C水浴，水面勿没过管盖），擦干表面，酒精消毒后打开。避免冻存管在室温放置过久导致外部冷凝水渗入。

2. 纯度与活性验证： 复苏后的第一代菌种必须进行纯度检查！ 通过镜检（观察形态一致性）、平板划线（观察单菌落形态是否单一）和生化鉴定（如必要）等手段确认无杂菌污染。同时检查其活性（生长情况）。

3. 记录： 详细记录复苏日期、操作者、验证结果（纯度、活性）。只有验证合格的菌种才能用于后续实验或生产。

结语

菌种保藏过程中的污染防控是一项系统工程，涉及环境、人员、物料、操作、存储、验证等方方面面。它要求每一位操作人员具备强烈的无菌意识、严谨的操作习惯和一丝不苟的责任心。对于北京百欧博伟生物有限公司而言，建立并不断完善标准化的操作规程（SOP），加强人员培训与考核，落实日常监督与定期审计，是构建坚固防污染体系、确保菌种资源长期安全、稳定、可靠的核心保障。记住：每一次规范的操作，都是对珍贵生物资源最有力的守护；每一次严格的验证，都是对客户信任最郑重的承诺。让“零污染”成为菌种保藏的金标准！