高效酵母研究引擎：pRS426质粒的提取、培养与应用全攻略

         在分子生物学和酵母遗传学研究中，拥有强大且灵活的工具载体至关重要。pRS426质粒正是这样一款在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）研究领域被广泛应用的经典穿梭质粒（既能在大肠杆菌中复制，也能在酵母中复制）。作为专业的生物技术供应商，北京百欧博伟生物有限公司致力于为科研工作者提供优质的产品与技术方案。本文将带您深入了解pRS426质粒的核心特性，并详细介绍其在大肠杆菌中的高效提取与在酵母中的培养转化流程。

一、pRS426质粒：酵母研究的明星载体

pRS426隶属于著名的pRS系列质粒家族，由Robert Sikorski和Philip Hieter在1989年构建，是酵母遗传操作不可或缺的工具。其核心特点包括：

1. 高拷贝数 (High Copy Number): pRS426基于pBluescript SK(+)骨架，带有ColE1复制起点，在大肠杆菌中维持高拷贝数（通常>100 copies/cell），这使得从大肠杆菌中提取质粒DNA的产量非常高，极大地方便了质粒制备。

2. 酵母2μ复制起点 (2μ Origin): 该质粒携带完整的2μ质粒复制起点，使其能够在酿酒酵母中进行高拷贝、稳定的自主复制（通常>20 copies/cell），确保外源基因在酵母中高水平表达。

3. 酵母筛选标记 - URA3: pRS426使用URA3基因作为酵母中的筛选标记。URA3编码乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶，是尿嘧啶生物合成途径的关键酶。在缺乏尿嘧啶的合成培养基（如SD/-Ura）上，只有成功转化了pRS426（携带功能型URA3基因）的酵母菌株才能生长。这一筛选系统高效且常用。

4. 大肠杆菌筛选标记 - Amp⁺: 在大肠杆菌中，质粒通过氨苄青霉素抗性基因 (Amp⁺) 进行筛选，便于重组质粒在大肠杆菌宿主（如DH5α）中的扩增和保存。

5. 多克隆位点 (MCS): 质粒包含一个位于大肠杆菌lacZ基因内的多克隆位点，便于外源基因的克隆。利用蓝白斑筛选（需配合IPTG和X-gal）可以初步鉴定插入片段的重组子。

6. T7和T3启动子: 位于MCS两侧，可用于体外转录或测序。

总结pRS426的核心优势：

• 双穿梭： 轻松在细菌和酵母间穿梭。

• 双高拷贝： 在大肠杆菌和酵母中均为高拷贝，利于DNA制备和高水平表达。

• 强大筛选： 酵母端URA3标记，细菌端Amp⁺标记，筛选简便可靠。

• 灵活克隆： 便利的MCS和蓝白斑筛选。

• 广泛应用： 适用于酵母基因表达、功能互补、文库构建、蛋白生产等多种研究场景。

二、pRS426质粒的提取（从大肠杆菌）

pRS426的高拷贝特性使其在大肠杆菌中的提取相对高效。通常采用商业化的小量或中量质粒提取试剂盒（如百欧博伟提供的离心柱型质粒提取试剂盒），操作简便快捷。基本流程如下：

1. 培养： 将含有pRS426质粒的大肠杆菌单菌落（如DH5α）接种于含适量氨苄青霉素 (Amp, 通常100 μg/mL) 的LB液体培养基中，37°C剧烈振荡培养过夜（约12-16小时）。

2. 收集菌体： 取适量过夜培养液（根据试剂盒要求，通常1.5-5 mL），离心收集菌体沉淀。

3. 裂解： 使用试剂盒提供的裂解液（含SDS和NaOH）重悬菌体沉淀，充分裂解细胞壁和膜，释放内容物（包括质粒DNA、基因组DNA、RNA、蛋白质等）。此步骤需轻柔混匀，避免基因组DNA过度剪切。

4. 中和： 加入中和液（通常含醋酸钾），形成沉淀（SDS-蛋白质-脂质复合物及变性的基因组DNA大片段），离心去除沉淀。

5. 结合： 将含有质粒DNA的上清液转移到特定的离心吸附柱上。柱内的硅胶膜在高盐、低pH条件下能特异性地结合DNA。

6. 洗涤： 用洗涤液（通常含乙醇）洗涤吸附柱2-3次，去除盐分、蛋白质、RNA残留等杂质。

7. 洗脱： 用低盐缓冲液（如TE缓冲液或无菌水）洗脱纯净的质粒DNA。洗脱体积可根据需要调整（通常30-100 μL）。

8. 质检： 使用微量分光光度计（如Nanodrop）检测质粒DNA的浓度（ng/μL）和纯度（A260/A280比值，理想值约1.8；A260/A230比值，理想值>2.0）。通过琼脂糖凝胶电泳验证质粒大小和完整性（是否有降解或开环）。

三、pRS426质粒在酵母中的培养与转化

获得纯净的pRS426质粒后，即可用于转化酵母感受态细胞。常用的方法是醋酸锂（LiAc）法。

1. 酵母菌株准备：

   • 选择适合的酵母宿主菌株，该菌株必须是ura3突变体（如BY4741 ura3Δ），自身不能合成尿嘧啶，才能在SD/-Ura培养基上依赖质粒携带的URA3基因生长。

   • 从平板上挑取新鲜单菌落，接种于3-5 mL YPD液体培养基（完全培养基）中，30°C振荡培养过夜。

   • 取适量过夜培养物（如1-2 mL），转接到50-100 mL新鲜YPD中，继续30°C振荡培养至OD600≈0.4-0.6（约3-5小时，处于对数生长中期）。

2. 制备感受态细胞 (LiAc法):

   • 收集培养液，离心弃上清。

   • 用无菌水洗涤细胞沉淀一次。

   • 用1x TE缓冲液（pH 7.5）洗涤细胞沉淀一次。

   • 用0.1 M LiAc溶液重悬细胞沉淀（最终体积根据细胞量调整，使细胞密度较高）。

   • 30°C孵育15-60分钟（可选，有助于提高效率）。

3. 转化反应:

   • 在一个无菌离心管中混合：

     • 50 μL 制备好的感受态细胞悬液

     • 1-10 μL (约100 ng - 1 μg) 纯净的pRS426质粒DNA（或连接产物）

     • 50 μL 预混液（通常包含：50% PEG3350， 0.1 M LiAc, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA）。此步需充分混匀。

   • 加入鲑鱼精载体DNA（ssDNA，约10 μL，已煮沸变性并迅速冷却至室温）以竞争性抑制核酸酶并促进DNA摄取。充分涡旋混匀。

   • 30°C水浴孵育30分钟。

   • 加入DMSO至终浓度约10%（如加入10 μL），轻柔混匀。

   • 42°C热激15分钟。

   • 冰浴2分钟。

   • 离心（如5000 rpm, 30秒），小心弃去大部分上清液（留少量液体重悬细胞）。

   • 用0.5 - 1 mL 无菌水或1x TE缓冲液轻柔重悬细胞。

4. 涂板筛选:

   • 将重悬的转化细胞全部或部分涂布于SD/-Ura固体平板上（完全缺乏尿嘧啶的合成葡萄糖基础培养基）。

   • 30°C倒置培养2-4天，直到转化子（携带pRS426的酵母菌落）出现。

5. 阳性克隆验证:

   • 挑取平板上长出的单菌落进行验证。常用方法包括：

     • 菌落PCR： 使用特异性引物扩增插入片段或载体骨架。

     • 质粒拯救： 从酵母中提取质粒，转化回大肠杆菌，再进行酶切鉴定或测序。

     • 功能表型验证： 如果质粒携带特定基因，检测其功能（如报告基因活性、抗性、互补表型等）。

四、关键注意事项

• 无菌操作： 所有涉及细胞培养和转化的步骤均需严格无菌操作。

• 试剂质量： 使用高质量的水、试剂和培养基。

• 感受态细胞状态： 酵母菌处于对数生长期时转化效率最高。

• 质粒质量： 用于转化的质粒DNA应纯净、无降解。

• 筛选压力： 确保SD/-Ura平板配制正确，完全缺乏尿嘧啶。

• 培养条件： 酵母培养通常在30°C进行。

• 对照设置： 建议设置阳性对照（已知能转化成功的质粒）和阴性对照（无DNA或空载体），以评估转化效率和背景。

结语

pRS426质粒凭借其优异的双穿梭能力、高拷贝特性及可靠的URA3筛选系统，已成为酵母分子生物学研究中不可或缺的基石工具。掌握其高效提取（从大肠杆菌）和转化（到酵母）的核心方法，是开展相关研究的关键技能。北京百欧博伟生物有限公司作为专业的生物技术合作伙伴，可为您提供优质的pRS426质粒及相关试剂（如质粒提取试剂盒、培养基、抗生素等），并提供专业的技术支持，助您在酵母研究领域探索无限可能！