发根土壤杆菌（Agrobacterium rhizogenes）培养技术指南

一、发根土壤杆菌的生物学特性

发根土壤杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，因携带Ri质粒（Root-inducing plasmid）而具有诱导植物产生毛状根（Hairy roots）的能力。其特性如下：

1. 形态特征：短杆状，单生或成对，具鞭毛，可运动。

2. 生长条件：

   • 温度：最适生长温度25-28℃，37℃以上抑制生长。

   • pH范围：中性至弱碱性（pH 6.5-7.5）。

   • 营养需求：需有机氮源（如酵母提取物）、碳源（如甘露醇）及微量元素。

3. Ri质粒特性：T-DNA片段可整合至植物基因组，促进毛状根形成及次生代谢物合成。

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二、培养方法

1. 培养基配制

推荐使用以下培养基（北京百欧博伟提供专用配方）：

• YEB液体培养基：
  牛肉浸膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，蔗糖5 g/L，酵母提取物1 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L，pH 7.2。

• 固体培养基：添加1.5-2%琼脂。

2. 接种与培养步骤

1. 活化菌种：将冻存菌种划线接种于YEB固体培养基，28℃培养48小时。

2. 液体扩增：挑取单菌落接种至YEB液体培养基，28℃、200 rpm振荡培养24-36小时（OD₆₀₀≈1.0-1.5）。

3. 诱导准备：离心收集菌体，用无碳源培养基（如MS缓冲液）悬浮，调整菌液浓度至OD₆₀₀=0.6-0.8备用。

3. 毛状根诱导（植物共培养）

1. 将菌液浸泡或注射至植物外植体（如叶片、茎段）伤口处。

2. 共培养24-48小时（25℃暗培养），后转移至含抗生素（如头孢噻肟）的培养基清除细菌。

3. 筛选毛状根并继代培养。

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三、注意事项

1. 无菌操作：全程超净工作台操作，避免杂菌污染。

2. 生物安全：

   • 发根土壤杆菌为生物安全1级（BSL-1），但仍需规范操作，防止质粒扩散至环境。

   • 实验后需高温灭菌废弃物（121℃, 20分钟）。

3. 菌种保存：

   • 短期：YEB斜面4℃保存，每月转接一次。

   • 长期：添加15%甘油，-80℃或液氮冻存（北京百欧博伟提供菌种保藏服务）。

4. 植物材料选择：优先使用易感宿主（如烟草、人参、紫草等）。

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四、应用领域

北京百欧博伟生物技术有限公司提供的发根土壤杆菌及配套试剂广泛应用于以下领域：

1. 植物次生代谢物生产：

   • 高效生产药用成分（如人参皂苷、紫杉醇、青hao素）。

2. 基因功能研究：

   • 利用毛状根系统研究植物基因表达与调控。

3. 遗传改良：

   • Ri质粒介导的基因转化，培育抗逆/高产品种。

4. 生物反应器开发：

   • 规模化毛状根培养体系用于工业化提取活性物质。

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五、技术支持

北京百欧博伟生物技术有限公司提供：

• 优质发根土壤杆菌菌株（含Ri质粒，活性稳定）。

• 定制培养基及植物遗传转化试剂盒。

• 技术培训与实验方案优化服务。