原代细胞是如何培养的？选择组织块还是消化液培养法？

　　原代培养即直接从有机体取下细胞、组织或器官，让它们在体外维持与生长。原代培养的特点是细胞或组织刚离开机体，它们的生物性状尚未发生很大的改变，在一定程度上可反映它们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验，尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等，是极好的工具。

　　那么，原代细胞是如何培养的呢？

　　常用的原代培养法有组织块培养法和消化培养法。

　　（一）组织块培养法

　　许多实验室喜欢用组织块培养法进行原代培养，因为方法简单，细胞也较容易生长。尤其是培养心肌，有时还可观察到心肌组织块搏动。细胞从组织块边缘向外长出并铺满培养皿或培养瓶后，即可进行传代。

　　1.设备材料

　　培养箱、冰箱、超净工作台／无菌间、无菌吸管、离心管、酒精灯、试管架、培养瓶、培养皿、消化液、基础培养液、胎牛血清、Hanks溶液、双抗试液、剪刀、摄子、小烧杯。

　　2.操作步骤

　　（1）在无菌条件下，取待培养的组织适量，置入小烧杯中，以适量Hanks溶液清洗2~3次，去掉组织块表面的血污。

　　（2）用眼科剪将组织块反复剪成0.5~1mm3的小块。

　　（3）再用Hanks溶液反复漂洗，直至液体不混浊为止。等组织块下沉，将烧杯倾斜，用小吸管尽量吸除Hanks溶液。

　　（4）用含20%灭活血清及双抗溶液(200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素）的培养液再清洗，用吸管吸干后加入5ml含20％血清的培养液。

　　（5）用弯头吸管吸取组织小块，均匀地置于培养皿内表面，吸去多余的培养液，各组织小块之间相距0.5cm为宜。盖好培养皿盖，做好标记，置37°C的CO2培养箱内。

　　（6）2~4h后，于超净工作台中，缓缓地向培养皿中加入上述含20％血清及双抗溶液(100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素）的培养液少量，以使组织块浸没在培养液中。

　　（7）轻轻地将培养皿及组织块移至CO2培养箱，如无特殊情况，不必观察。1~2周后，可观察到细胞从组织块边缘长出，形成生长晕。

　　（9）一般说来，若培养液无明显改变，1周换液1次即可。待细胞长满整个培养皿内表面，即可进行传代培养。

　　3.需要说明及注意的问题

　　（1）如果是用培养瓶而不是培养皿，则接种组织块千培养瓶底壁后，要轻轻地翻转培养瓶，令瓶底在上，盖好瓶盖后轻轻置入37°C的CO2培养箱，2~4h后，取出培养瓶，在超净工作台内打开瓶盖，仍令组织块在上方。在组织块对面瓶壁加入适量上述培养液。然后，轻轻翻转培养瓶，让组织块浸没于培养液中。盖好瓶盖后放回二氧化碳孵箱，继续培养。

　　（2）从培养皿表面游离下来的组织块，弃去即可。

　　（3）如果使用玻璃培养瓶，而不是新的塑料培养瓶，则最好在玻璃底表面包被大鼠鼠尾胶原，这样不但有利于组织块的黏附，而且可使细胞生长得更好。

　　（4）本方法适于各种组织的培养，操作者还可根据自己的实验需要和细胞种类加以修改。

　　（二）消化培养法

　　它与上述组织块培养法的主要区别有2点。一要用酶制剂（最常用的是胰蛋白酶）处理组织块，除去细胞间质，使细胞相互分离，形成细胞悬液；二细胞生长方式多为单层(monolayer)。本方法的优点在于单层细胞更易摄取营养、排出代谢产物，因此生长较快，可较快地应用于实验研究；缺点是步骤颇为繁琐，操作不慎易污染。此外，消化处理要恰到好处，不然对细胞会有一定的损伤作用。

　　1.操作程序

　　（1）在无菌条件下，取待培养的组织1cm3左右，置入平皿或烧杯中，以适量Hanks溶液消洗3次，去掉组织块表面的血污及结缔组织。

　　（2）以锋利的眼科剪将组织块反复剪碎，得到约0.5mm x 1mm大小的小块。

　　（3）以Hanks溶液冲洗数遍，稍候组织块下沉，吸除Hanks溶液。

　　（4）用少量Hanks溶液，将组织小块吸入预先置有无菌的磁力搅拌子的锥形烧杯中，再加入15~30ml上述胰蛋白酶消化液。

　　（5）将锥形烧杯用橡皮塞盖紧，外封以锡箔。然后移至预先置入37°C培养箱内的电磁搅拌器上。

　　（6）打开搅拌器的电源开关，使搅拌子旋转，关好培养箱，让胰蛋白酶进行消化。

　　（7）在消化过程中，每隔一定时间吸取消化物滴于载片上，于光学显微镜下观察，检查细胞是否分散成单个。若大部分细胞已分散，立即加入适量Hanks溶液，终止消化。通常需消化10~20min。

　　（8）先以100μm不锈钢筛过滤，滤去未消化的组织块或大细胞团（如获得的细胞量少，这些组织块可继续进行消化，以便取得较多细胞）。继以20μ不锈钢筛过滤。

　　（9）将取得的滤液进行低速（每分钟500~1000转）离心5min，吸除上清液。并用Hanks溶液离心清洗1~2次，最后加入含血清的培养液，搅匀，制成细胞悬液。

　　（10）用计数板计数，确定细胞悬液浓度，通常以1×105~3×105个接种于培养瓶或培养皿中。

　　2.需要说明及注意的问题

　　（1）用何种酶进行消化可视所培养细胞而定，除胰蛋白酶外，常用1型胶原酶消化睾丸支持细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞；用II型胶原酶消化大鼠腺垂体细胞等。

　　（2）如果没有不锈钢筛，可用4层纱布代替，但纱布要预先经高温高压灭菌。

　　（3）严格地说，原代培养是指未经传代的细胞，但在实际工作中，人们常将10代以内的细胞用作原代培养细胞，因为此时的细胞基本上保持着原有的生物学特性。

　　（4）从原代培养的操作步骤不难看出，原代细胞中含有多种细胞成分，即它们是异质型(heterogeneity)的群体，因此在设计实验及分析结果时，切勿忘记这一因素。