原代细胞分离提取指南：7个关键步骤

　　原代细胞是直接从活组织（如活组织检查材料）中提取的细胞，用于体外培养。这些细胞经历了非常少的群体倍增，因此比连续细胞系（如肿瘤或人工永生化细胞系）更能代表其衍生组织的主要功能成分。分离原代细胞的方法有很多种，其中最常用的是酶消化法。以下是优化原代细胞分离提取的7个关键步骤：

　　无菌操作🧼

　　必须使用无菌设备、试剂和技术来收集和处理组织。使用专业防护设备以避免污染，并用0.22微米的膜无菌过滤所有酶和试剂。

　　切块🔪

　　用无菌剪刀或手术刀将组织标本切成小块（通常为2×4mm），然后将小块放入选定的缓冲液、培养基或盐溶液中。

　　加酶🌿

　　将组织清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入选择的酶，如胶原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，酶的浓度为0.5 mg/ml～1.5 mg/ml。

　　孵育🕰️

　　将组织样本在其最佳温度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分钟。定期混合或轻轻摇动标本。

　　洗涤🚿

　　通过轻轻移液来分散细胞（也称为研磨），然后使用细网过滤细胞悬浮液。让细胞沉淀并滗出多余的含液酶；洗两到三次。含有FBS、BSA或其他抑制剂的洗涤溶液也可用于阻止酶消化。

　　分析🔬

　　将细胞重悬于正确的培养基或缓冲液中，然后定量测定细胞产量和活力。大多数研究人员使用血细胞计数器测定细胞产量，并使用台盼蓝重氮染料测量细胞活力。

　　培养🌱

　　根据所分离的细胞类型，选择最适合研究的方案和处理步骤来培养细胞。

　　注意事项⚠️

　　使用细胞分离酶时，请注意温度和湿度条件。如蛋白水解酶可以自动分解，因此建议在使用前立即将其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

　　通常用于细胞分离的大多数酶可以直接溶解于平衡盐溶液或所选缓冲液中。确保解离期间的组织存活，需要孵育培养基充分氧化并在生理pH下缓冲。95%O2、5%CO2平衡的介质来完成。

　　通过以上步骤，您可以成功分离和提取原代细胞，为后续研究提供更有代表性的体内模型。