微生物实验用菌种的保存方法及注意事项

　　微生物实验所使用的菌种，作为新产品研发与生产质量控制的关键物质，其采集与管理显得尤为重要。为确保实验的准确性、灵敏性，同时保障人员与环境的卫生安全，我们特此制定以下菌种采集与使用规定：

　　菌种采集途径

　　实验室用菌种主要来源于国家法定机构、ATCC菌种购买，以及科研中的菌种交流。无论何种来源，均需公司统一采集，并严格遵循规范操作，确保包装可靠、采集迅速，避免泄漏与污染，从而保障菌种质量与环境安全。同时，采集过程中必须做好菌种传代标识，以追溯菌种来源与历史。

　　菌种活化要求

　　购买的标准菌种需为冻干粉形态，而科研中交流的菌种可为斜面或液体状。在活化方面，首次活化建议使用非选择性琼脂培养基，除非特殊情况或特别推荐，否则一般不采用液体培养基。具体培养基使用情况详见下表，详细的菌种使用方法可参阅附表。

　　方法：

　　胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、非选择性羊血琼脂、PCA或营养琼脂，于35℃环境下培养24-48小时。

　　非选择性羊血琼脂，同样条件下培养。

　　巧克力琼脂平板，在35℃、5-10%CO2的环境下培养。

　　CDC厌氧血琼脂，于35℃厌氧环境下培养48-72小时；部分专性厌氧菌可能需要5-7天才能充分生长。对于梭菌，可选择营养琼脂、TSA琼脂或PCA琼脂，培养48-96小时。

　　沙堡氏葡萄糖Emmons琼脂，在25-28℃下培养3-7天；也可使用PDA琼脂。

　　巧克力琼脂平板，于35℃微需氧环境下培养48-72小时。

　　改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂，在35℃、5-10%CO2或正常环境下培养7天。

　　缓冲活性碳酵母提取物琼脂，于35℃下培养3-5天。

　　巧克力琼脂平板，在35℃、5-10%CO2环境下培养48小时。

　　先用脑心浸出液肉汤或TSB培养基进行增菌培养，再划线至TSA琼脂上继续培养。

　　先接种于MRS肉汤增菌培养，再划线接种至含羊血的哥伦比亚CNA培养基上培养。

　　PDA琼脂，于45℃下培养48-72小时。

　　先接种于10B精氨酸肉汤，进行系列梯度稀释后，于35℃下培养至培养基变粉红色，再接入A-8琼脂。

　　菌种保存：

　　所有菌种均由实验室专人（双人双锁）保存于专用冰箱或其他适当方式。需建立菌种登记台帐，详细记录菌种的各项情况。具体保存方法如下：

　　1干粉菌种：保存于2-8℃冰箱中，可长期保存。

　　2斜面菌种或液体菌种：可使用液氮罐进行长期保存，每种菌种保存5管。

　　（1）为了液氮保藏，我们需要准备能够耐受温度急剧变化的安瓿管或菌种保存管，通常选用硼硅酸盐玻璃制造的，尺寸为75×10mm或能容纳2mm液体的塑料管。

　　（2）在加保护剂与灭菌时，若要保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等易分散的细胞，可以将空安瓿管塞上棉塞后，在121℃下灭菌15分钟。若要保存霉菌菌丝体，则需在安瓿管内预先加入如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液等保护剂，加入量以能浸没菌落圆块为准，再同样灭菌。

　　（3）接入菌种时，将菌种制成菌悬液装入已灭菌的安瓿管，或用灭菌打孔器从平板内切取霉菌菌丝体的菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

　　（4）冻结过程中，需以每分钟下降1℃的慢速将安瓿管冻结至-30℃。避免细胞急剧冷冻，以防形成冰结晶降低存活率。

　　（5）保藏时，将冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，再将小圆筒放入液氮保藏器内，其中气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

　　（6）恢复培养时，从液氮中取出安瓿管，立即放入38-40℃的水浴中急剧解冻，直至内容物完全融化。然后打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上进行培养。

　　此方法适用于一般微生物的长期保藏，包括一些难以用冷冻干燥法保存的微生物如支原体、衣原体等。它能够确保菌种的性状在长期保藏过程中保持稳定，不发生变异。

　　2液体石蜡保存法：首先，将液体石蜡分装至三角烧瓶内，塞上棉塞并用牛皮纸包扎，随后在121℃下灭菌30分钟。接着，将灭菌后的三角烧瓶置于40℃温箱中，使水分蒸发掉，以便备用。

　　接下来，将需要保藏的菌种在适宜的斜面培养基上进行培养，直至得到健壮的菌体或孢子。然后，用灭菌吸管吸取适量灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，确保液面高出斜面顶端1cm，以隔绝菌种与空气的接触。最后，将试管直立保存于低温或室温环境中（某些微生物在室温下的保藏时间甚至超过冰箱）。

　　此外，对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等特定微生物，也可以采用另一种保藏方法：在半固体培养基上接种这些微生物，于36±1℃下培养18-24小时后，加入无菌石蜡油进行覆盖，再保存于2-8℃的冰箱或室温环境中。这种方法可有效延长这些微生物的保藏时间，达到1-2年之久。需要注意的是，对于副溶血性弧菌的保藏，需将其接种于含盐的半固体培养基上，并在36±1℃下培养18-24小时后，同样加入无菌石蜡油进行覆盖和保藏。

　　产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌，以及厌氧消化链球菌，均适宜接种于CDC厌氧菌琼脂中。经过18-24小时的培养后，用无菌石蜡油进行覆盖，并保存在2-8℃的冰箱或室温环境中。这种方法可有效延长这些菌种的保藏时间，长达1-2年。

　　对于酵母菌，建议接种于YPD培养基中，并在28℃下培养24-48小时。培养完成后，同样加入无菌石蜡油进行覆盖，并保存于2-8℃的冰箱或室温中。保藏时间同样可达1-2年。

　　若需保藏霉菌和白色念珠球菌，可将其接种于PDA培养基中，于28℃下培养24-48小时。之后，用无菌石蜡油进行覆盖，并保存于2-8℃的冰箱或室温环境中。这种方法的保藏效果也可维持1-2年。

　　链球菌属的菌种保藏，则需接种于羊血琼脂上，并在36±1℃下培养24-48小时。培养完成后，同样加入无菌石蜡油进行覆盖，并保存于2-8℃的冰箱或室温中。这种保藏方法同样适用于副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌以及流感嗜血杆菌等需特定环境的微生物。

　　对于分枝杆菌属的菌种保藏，则需接种于改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂上，并在36±1℃下培养7天。培养完成后，加入无菌石蜡油进行覆盖，并保存在2-8℃的冰箱或室温环境中。这种保藏方法同样可维持1-2年的保藏时间。

　　在菌种制备方面，应严格按照批准的制备计划进行操作，并详细记录菌种名称、传代标识和制备数量等信息。同时，还需要定期对菌种进行比浊计数等质量监控措施，以确保菌种的活力和纯度。

　　1）对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌属、沙门氏菌属、副伤寒沙门氏菌、李斯特氏菌属、蜡样芽胞杆菌、八叠球菌、短芽孢杆菌、大肠杆菌HB10大肠杆菌DH5a、猪肺疫、禽多杀性巴氏杆菌（禽霍乱）、猪丹毒、大肠杆菌O1大肠菌群、产气肠杆菌以及志贺氏菌属等细菌，建议采用划线接种法，将菌种划线于营养琼脂平板上，于36±1℃下培养18-24小时。随后，挑取单菌落并接种于10ml营养肉汤中，继续在相同条件下培养。培养完成后，用生理盐水稀释菌液至10-7，并计数出10-6/1ml和10-7/1ml营养肉汤中的细菌数。最后，将菌液保存于2-8℃环境中，保存期限可达7-10天。每10天需重新挑取单菌落进行传代培养。

　　2）对于产气荚膜梭菌、梭杆菌属、拟杆菌属等厌氧菌以及厌氧消化链球菌，可直接接种于10ml液体硫乙醇酸盐培养基中，同样在36±1℃下培养18-24小时。培养完成后，同样方法计数每ml培养基中的细菌数，但需在厌氧条件下进行。

　　3）酵母菌、霉菌和白色念珠球菌则应接种于PDA培养基中，于28℃下培养24-48小时。之后，挑取单菌落并接种于10ml葡萄糖蛋白胨培养基中，继续培养。培养完成后，同样用生理盐水稀释至10-7，并计数出相应稀释度下的菌落数。这些菌种同样可保存于2-8℃环境中，保存期限为7-10天，并需定期传代。

　　4）对于链球菌属，建议将其接种于脑心浸液中，于36±1℃下培养18-24小时。随后，用生理盐水稀释菌液至10-7，并计数出10-6/1ml和10-7/1ml脑心浸液中的细菌数。菌液可保存于2-8℃环境中，保存期限为7-10天，但需每10天重新传代培养。

　　5）针对副嗜血杆菌、淋病奈瑟菌（需5-10%CO2环境）、脑膜炎奈瑟菌（需5-10%CO2环境）以及流感嗜血杆菌，推荐使用巧克力琼脂作为培养基，同样在36±1℃下培养18-24小时。培养完成后，用9%无菌氯化钠溶液稀释菌液，并经比浊法制成每1ml含菌数约等于100～1000cfu的菌悬液。

　　6）对于分枝杆菌属，应接种于改良罗氏琼脂或Middlebrook琼脂中，于36±1℃下培养7天。随后，用9%无菌氯化钠溶液将新鲜培养物稀释至0~0×103CFU/ml，制成工作菌液。

　　5）关于菌种的标识和使用期限，我们规定干粉菌种为第0代，每次转接斜面即增加一代。例如，单增李斯特氏菌ATCC19114第0代应标识为单增李斯特氏菌ATCC19114-0，第一代则标识为单增李斯特氏菌ATCC19114-1。同时，我们要求传代次数不得超过5代，以确保菌种的稳定性。

　　6）在菌种使用方面，我们要求菌种管理员每月领取一定量的第一代（或第二代、第三代）菌种，并按照上述方法制备工作菌液。实际使用者需在领用前充分考虑重复实验的需求，并确保同一实验中使用同一代次的菌种，以保证实验结果的可比性。领用菌种时需详细登记，领用人需签字并注明领用时间。

　　菌种处理

　　实验结束后，对菌种遗留物和污染物必须依照三废处理的相关规定进行妥善处理。若需向外部提供菌种，必须获得公司总经理的批准，并严格按照规定要求进行包装与运输。私自对外提供菌种的行为是严格禁止的。