菌落传代操作规范和实验步骤

　　霉菌培养箱是适合培养霉菌等真核微生物的试验设备，因为大部分霉菌适合在室温（25摄氏度）下生长，且在固体基质上培养时需要保持一定的湿度，所以一般的霉菌培养箱由制冷系统，制热系统，空气加湿器和培养室，控制电路和操作面板等部分组成，并使用温度传感器和湿度传感器来维持培养室内的温度和湿度的稳定。有些特殊的霉菌培养箱还可以设定温度湿度随培养时间变化。

　　为了提高对实验用菌种的使用、管理，通过对菌种的传代、保存，从而确保其在实验中的有效性和准确性。

　　范围:无菌检验、微生物限度检查检验用菌株。

　　传代前将购进菌种及灭菌后的营养琼脂小斜面置于室温放置30分钟，待温度平衡后再移入阳性操作室内。

　　换好衣服，做好防护。

　　第二、三代工作菌种的制备:

　　从超低温冰箱中取出所需的菌种冷冻管，置于35~40℃的水浴中进行解冻1分钟。解冻后，放入生物安全柜内，用冷却后的灭菌接种环从冷冻管中取一环菌液接种于10ml灭菌营养肉汤培养基中，置于30~35℃的培养箱内18~24小时，进行增菌培养。(第二代)培养后，用冷却的灭菌接种环从增菌液中沾取一环接种于相应的培养基斜面上贴上菌种标签，置于30~35℃的150L霉菌培养箱内18~24小时，进行培养。确认符合后置于5℃的冰箱内保存。使用时将培养出的斜面用、5ml的灭菌生理盐水将斜面上的菌落洗下制成菌悬液使用。(第三代)在第三代菌种有效期内进行第四代的接种传代。

　　第四、五代工作菌种的制备:

　　从5℃的冰箱内取出第三代工作菌种，用冷却的灭菌接种环挑取1个菌落接种于相应的琼脂斜面培养基中，置于30~35℃的150L霉菌培养箱内培养18~24小时后，确认符合后置于5℃的冰箱内作为第四代工作菌种保存，备用。

　　接种操作规范

　　点燃酒精灯，左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒钟，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。右手用无名指、小指及掌部夹住硅胶塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开硅胶塞，将接种环伸入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮取少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。塞上硅胶塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂小斜面一支，右手用无名指、小指及掌部夹住硅胶塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拨开硅胶塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的底部，由低向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使菌划在斜面的表面上。

　　取出接种环，在火焰旁将培养基管硅胶塞堵上，然后将接种过菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。

　　将已接种好的细菌管置30℃一35℃细菌培养箱培养18-24小时，霉菌管置23℃-28℃150L霉菌培养箱培养5-7日。取出后放入冰箱保存并上锁。

　　菌种的传代次数不得超过5代，每一菌株每次传代不超过15支;1支作为下次传代用，其余作为检验用，每月传代一次。

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