贴壁细胞传代培养的基本步骤

　　我们知道开始培养的细胞不能无限期地生长，因为受限区域内的细胞数量不断增加，营养物质也会被消耗，从而导致有毒的代谢产物增加，另外根据实验或生产需要，也要对细胞进行扩大培养。通过去除培养基并将细胞转移到新鲜的生长培养基和基质中，细胞获得了新鲜的营养并去除了有毒代谢物，从而可以长期维持培养。这个过程就属于传代培养，传代培养的细胞密度会低于原始培养物中的细胞密度。当接种细胞后，细胞生长会经过滞后期、对数期，稳定期和凋亡期。在凋亡期，细胞会因缺乏营养或培养条件不当而死亡。贴壁细胞传代培养步骤如下：

　　一、细胞检查

　　细胞解冻后需要进行细胞状态检查，确保细胞生长状态正常，确保无细菌污染、无支原体污染。培养贴壁细胞时，主要贴壁于培养皿或烧瓶底部，培养基呈粉橙色。由于培养基中细胞（或污染）的代谢产物酸化，pH指示剂酚红变黄。MDCK细胞在对数生长期呈多边形，单层生长。使用正常的明场照明很难看到它们。通过切换到相衬，可以更容易地识别细胞。

　　记录细胞状态对于确保实验结果一致非常重要。通过活细胞成像仪可以通过远程控制轻松成像和保存。研究人员可以拍摄细胞图像以跟踪培养状态并将图像传输到智能设备或U盘。

　　二、细胞收获

　　1.将培养基从细胞中吸出到废物容器中。也可以使用连接到瑞宁的真空吸液器。

　　2.用5 ml不含Ca和Mg的预热PBS小心洗涤细胞最多3次，以去除残留培养基中的胎牛血清(FBS)。FBS或FBS替代品会抑制胰蛋白酶。加入3 ml含EDTA的胰蛋白酶并轻轻晃动覆盖贴壁的细胞并在37°C的水浴锅中孵育并解离细胞。不同的细胞系需要不同的胰蛋白酶孵育时间。为避免过度胰蛋白酶消化会损坏细胞，请每隔几分钟在显微镜下检查一次。

　　3.轻轻冲洗板并将细胞悬浮液转移到50 ml试管中，并以800 rpm的速度向下旋转5分钟

　　分离的细胞应呈圆形并在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。一旦细胞分离，向培养皿中加入5 ml培养基以使胰蛋白酶失活。

　　4.分离的细胞应该是圆形的并且在胰蛋白酶溶液中自由漂浮。

　　三、细胞计数

　　1.由于台盼蓝可以选择性地穿透死细胞的细胞膜将死细胞染成蓝色，所以使用台盼蓝溶液染色有利于观察细胞的活力。根据这一特点我们将100UL细胞悬浮液与100UL的0.4%的台盼蓝溶液混合均匀后，再进行细胞观察。

　　2.将移液器吸头放在盖玻片边缘并轻轻排出细胞悬浮液，从而将细胞悬浮液装入计数室（每个计数区约4µl）。盖玻片下的区域通过毛细管作用填充。

　　3.将细胞计数板放在细胞计数仪中进行细胞计数。

　　四、稀释

　　1.将所需体积的细胞（适当数量的细胞）以所需的分流比（此处为1:10）吸取到新培养皿中，然后用培养基将其加满至每个培养皿中所需的体积（10毫升）。注意培养皿盖上的细胞类型、细胞分裂日期和传代数。将细胞放回37°C的培养箱中。

　　2.以所需的分流比将所需体积的细胞（适当数量的细胞）移入新培养皿中。

　　让细胞过夜以恢复和沉淀。24小时后，用显微镜检查细胞的形状、粘附和是否存在污染。

　　3.细胞应该附着在培养皿底部并且已经开始生长和分裂。更换培养基以去除任何残留的解离剂或细胞碎片。培养细胞直到它们融合并准备好进行实验或下一次传代培养。

　　4.细胞应当附着在培养皿底部并开始生长和分裂。